葡萄籽中蛋白质的提取

□ 温小娟 吴 丹 乌海市检验检测中心

贺兰山东麓酿酒葡萄种植地是我国三大酿酒葡萄原产地之一。乌海市就位于该产地北侧，且与世界红酒之乡—法国波尔多处于同一纬度（北纬39°），常年干旱少雨、葡萄生长季节昼夜温差显著、日照时间长、无霜期长，属于温带大陆性气候区，适宜葡萄生长，具有糖度高、色泽好、品质佳的特点，是种植葡萄的“黄金地带”[1]。近年来乌海葡萄酒产业发展趋势良好，兴起多家葡萄酒企业，形成了集酿酒—农畜产品—旅游为一体的绿色沙漠葡萄酒产业链。全市4家大型葡萄酒加工企业中，汉森葡萄酒厂2014年的葡萄酒生产能力已达2万吨，为内蒙古最大的葡萄酒生产加工企业[2]。据了解，在酿酒季这些葡萄酒厂往往会产生大量的葡萄籽、皮残渣等副产物，而大部分酿酒副产物均作为粗饲料和肥料来使用，如能充分利用酿酒过程中产生的籽渣等副产物，则可进一步促进葡萄酒产业链的发展，在减少资源浪费、保护地区环境的同时，给企业创造更多的经济价值。

1 葡萄籽蛋白质概述

葡萄籽中含有粗蛋白约8.0%、多酚约6.8%、碳水化合物约32.7%。籽中氨基酸丰富且含量均衡，共有18种，其中有甲硫氨酸（Met）、苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）、赖氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）7种人体必需氨基酸[3]。且4种氨基酸与大豆蛋白的氨基酸含量非常接近，可运用于生产强化食品、保健食品等[4]。对葡萄籽提取物的深入、广泛研究利用尚存在较大的发展空间，例如对葡萄籽进行蛋白质、多肽提取等[5]。

本文以酿酒后葡萄渣中的果籽为材料，选取来自两个不同产地的葡萄籽（葡萄籽样品1来自乌海，葡萄籽样品2来自银川）同时进行试验。采用NaCl溶液提取法在不同影响因素下对葡萄籽中的蛋白质进行提取，改变粒度目数、浸提溶液浓度、温度条件、固液比例与提取时间5种条件参数，利用单因素法分析各因素在不同实验水平下对其蛋白提取程度的影响，再经正交试验优化，从而最终选定最优的葡萄籽蛋白质浸提条件。

2 葡萄籽蛋白的提取工艺

2.1 工艺流程

葡萄籽→烘干→粉碎过筛→脱脂浸提沉淀→调pH值为中性→离心弃去上清液→等电点酸沉→离心取上清液→干燥去除水分→葡萄籽蛋白。

2.2 预处理

将两种葡萄籽样品放入烘箱中在55 ℃下烘12 h，烘干后粉碎，经目数为18、40、60与80目的筛子筛选。为避免葡萄籽粉中的油脂影响蛋白质提取，需用正己烷以1∶5的料液比对葡萄籽粉进行脱脂，时间为2 h，之后过滤，分离出的上清液中含葡萄籽油，沉淀则为脱脂后葡萄籽粕，重复3次，然后检测葡萄籽粕中的蛋白。

3 NaCl溶液浸提法提取葡萄籽中所含蛋白质

3.1 单因素试验

3.1.1 蛋白质浸提率受不同粉碎粒度（目数）作用的变化情况

准确称量不同粒度（18、40、60与80目）的脱脂葡萄籽粕各1.000 g，分别放入4支50 mL离心管中，按固液比为1∶20各加入20 mL浓度为1.0 mol/L的NaCl溶液，在温度为40 ℃的恒温水浴箱中浸提40 min。设定离心机转子速度为3 000 r/min，时间为15 min，保留经离心处理所得上清液，弃去沉淀。

3.1.2 蛋白质浸提率受不同NaCl浓度作用的变化情况

准确称量粒度是60目的葡萄籽粉各1.000 g，放入50 mL离心管中，以固液比1∶20分别加0.5、1.0、1.5 mol/L与2.0 mo1/L的NaCl溶液20 mL，在温度为40 ℃条件下水浴浸提40 min。设定离心机转子速度为3 000 r/min，时间为15 min，保留经离心处理所得上清液，沉淀弃去。

3.1.3 蛋白质浸提率受不同料液比例作用的变化情况

准确称量粒度是60目的葡萄籽粉各1.000 g，放入50 mL离心管中，依次以固液比1∶10、1∶15、1∶20与1∶25加入1.0 mol/L NaCl溶液，在温度为40 ℃的条件下水浴浸提40 min。设定离心机转子速度为3 000 r/min，时间为15 min，保留经离心处理所得上清液，弃去沉淀。

3.1.4 蛋白质浸提率受不同温度条件作用的变化情况

准确称量粒度是60目的葡萄籽粉各1.000 g，放入50 mL离心管中，以料液比1∶20加1.0 mol/L NaCl溶液20 mL，分别在 30、35、40 ℃与45 ℃的温度条件下水浴浸提40 min。设定离心机转子速度为3 000 r/min，时间为15 min，保留经离心处理所得上清液，沉淀弃去。

3.1.5 蛋白质浸提率受不同浸提时间作用的变化情况

准确称量粒径是60目的葡萄籽粉各1.000 g，放入50 mL离心管中，以料液比1∶20加1.0 mol/L的NaCl溶液20 mL，在温度为40 ℃的恒温水浴箱中分别浸提30、40、50 min与60 min。设定离心机转子速度为3 000 r/min，时间为15 min，保留经离心处理所得上清液，沉淀弃去。

3.2 正交试验设计

以单因素试验结果为依据，选取A（NaCl浓度 0.5、1.0、1.5 mol/L）、B(固液比1∶15、1∶20、1∶25)、C（温度35、40、45 ℃）、D(提取时间30、40、50 min)这4个要素，每因素取3个水平，采用L9（34）正交实验，分析确认盐溶法提取葡萄籽蛋白的最佳参数。

4 葡萄籽蛋白质的检测指标

4.1 葡萄籽蛋白质含量的检测方法

依据国家标准（GB 5009.5—2016）检测和计算葡萄籽中所含蛋白质总量。浸提液中所含蛋白的量利用考马斯亮蓝法进行检测和计算[6]。同时以牛血清蛋白作为标液，将测得的吸光度值作为纵坐标、浓度作为横坐标，制作标准曲线，如图1。

图1 牛血清蛋白标准曲线

蛋白质提取率计算公式：

4.2 葡萄籽蛋白质等电点（pI）检测方法[7]

用3 mol/L HCl溶液调节提取后的蛋白溶液pH值分别至3.40、3.57、3.70、3.80、3.96、4.05和 4.13， 静置30 min后，在3 500 r/min的转速下离心处理10 min，取上层清液，并稀释30倍，将紫外分光光度计波长设定在595 nm处，对提取后的溶液进行吸光度测定，其中吸光度值最低时的pH即为此蛋白的等电点（pI）。

5 结果与分析

5.1 葡萄籽中所含蛋白质总量

用自动凯氏定氮仪测出葡萄籽样品1、2中所含蛋白质的总量分别为12.79%和14.15%。可能因两种葡萄籽产地各异，导致所含总蛋白质不同。

5.2 葡萄籽蛋白质的等电点（pI）

两种葡萄籽样品提取蛋白后溶液在pH=3.8附近处其吸光度值最低，等电点环境下蛋白质分子呈两性离子状态，净电荷总数为0，粒子间无电荷相斥作用，稳定性最差，溶解度也最小，因此该点为葡萄籽蛋白的等电点，即pI为3.8。所以，加入弱酸将蛋白质提取液pH调至等电点（pI），此时极易凝集析出蛋白质。此外，该试验测得两种样品蛋白质等电点一致，表明其等电点与葡萄样品品种无关。

5.3 NaCl溶液浸提法的单因素实验分析

5.3.1 葡萄籽提取液中蛋白质含量随目数大小的变化

分别测得样品1、2不同粒度目数下的蛋白质提取液吸光度值，代入标曲得出蛋白质含量，并根据公式计算出提取率，见表1。

结果分析：60目时样品1、2提取液中蛋白含量最高，此时蛋白提取率最大分别为61.93%、49.42%。

5.3.2 葡萄籽提取液中蛋白质含量随NaCl浓度高低的变化

分别测得样品1、2不同NaCl浓度的蛋白质提取液吸光度值，代入标曲得出蛋白质含量，计算出提取率，见表2。

结果分析：1.0 mol/L时样品1、2提取液中蛋白含量最高，此时蛋白提取率最大分别为52.90%、48.88%。

5.3.3 葡萄籽提取液中蛋白质含量随料液比大小的变化

分别测得样品1、2不同料液比的蛋白质提取液吸光度值，代入标曲得出蛋白质含量，并计算出提取率，见表3。

结果分析：料液比为1∶20时样品1、2提取液中蛋白含量最高，提取率最大分别为53.82%、48.60%。

5.3.4 葡萄籽提取液中蛋白质含量随浸提温度高低的变化

分别测得样品1、2不同温度条件下所得蛋白质提取液的吸光度值，代入标曲得出蛋白质含量，并计算出提取率，见表4。

结果分析：40 ℃时样品1、2提取液中蛋白含量最高，此时蛋白提取率最高分别为60.70%、46.99%。

5.3.5 葡萄籽提取液中蛋白质含量随浸提时间长短的变化

分别测得样品1、2不同提取时长下所得蛋白质提取液的吸光度值，代入标曲得出蛋白质含量，并计算出提取率，见表5。

结果分析：40 min时样品1、2提取液中蛋白含量最高，此时蛋白提取率最大分别为47.90%、44.05%。

5.4 NaCl浸提法提取蛋白质正交分析结果

以单因素试验结果为基础，经L9（34）的正交设计和实验数据分析，以选择确定NaCl溶液浸提法提取葡萄籽中所含蛋白的最佳参数，试验材料选用葡萄籽样品1（乌海）。

表6得知，4个因素中极差R最大的是C为15.470，其次是A为14.250，再次是B为12.093，最后是D为7.886，因此，葡萄籽样品1的蛋白浸提量随四因素变化的强弱程度为C＞A＞B＞D。

统计分析各因素实验结果可得：利用NaCl溶液浸提法对葡萄籽中所含蛋白进行浸提的最适宜参数为A2B2C2D2，即以1.0 mol/L浓度的NaCl溶液，按1∶20的料液比，于温度为40 ℃的水浴中提取40 min，所得蛋白质提取率最高64.46%。

表1 葡萄籽提取液中蛋白质含量随粒度目数大小的变化

表2 葡萄籽提取液中蛋白质含量随NaCl浓度高低的变化

表3 葡萄籽提取液中蛋白质含量随料液比大小的变化

表4 葡萄籽提取液中蛋白质含量随浸提温度高低的变化

表5 葡萄籽提取液中蛋白质含量随浸提时间长短的变化

表6 盐法浸提葡萄籽中所含蛋白的正交数据结果

6 结论

选取两种葡萄籽（乌海，银川）为原料，对蛋白质的提取进行试验和分析，最终得出以下结论。

蛋白质含量及等电点：葡萄籽样品1、2所含蛋白质总量分别为12.79%和14.15%；葡萄籽蛋白质的等电点pI为3.8。

NaCl溶液浸提法对葡萄籽进行蛋白质提取的研究结果：该方法最优参数条件为粉碎粒度60目，料液比1∶20，NaCl浓度1.0 mol/L，提取温度40 ℃，浸提时间40 min。在此条件下，葡萄籽样品1、2提取蛋白最高率分别为64.46%、49.42%。盐法正交实验结果表明：NaCl溶液浸提法中不同因素条件变化对蛋白质浸提程度作用的强弱为温度条件＞NaCl浓度＞料液比＞提取时间。