细叶香茶菜乙酸乙酯部位对肝癌HepG2细胞的影响

刘金海，谢 鹏，张会丽，李 梦，张萌萌

(郑州工业应用技术学院，河南 郑州 450000)

细叶香茶菜Rabdosiaternifolia(D.Don)Hara是唇形科(Latiabae)香茶菜属(Rabdosia)植物，别名三姐妹、三叶香茶菜、伤寒头、马鹿尾、虫牙药等，主要分布在云南西北部及四川西南部等地[1]。其性凉味苦，微辛；主要功效是解毒消肿止痛、发散风寒，民间用来治疗流行性感冒、压痛、毒蛇咬伤、痢疾等病[2]。现代研究表明细叶香茶菜具有抗肝损伤作用[3-4]。研究显示，细叶香茶菜中主要含有的化学成分为蒽醌、黄酮、香豆素、二萜、三萜、甾醇、挥发油、有机酸、酚类等[5-11]。本研究基于对细叶香茶菜乙醇提取物和不同极性部位研究基础上(另文发表)对其抗肝损及机制进行探讨，为细叶香茶菜的进一步研究提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 细胞

HepG2肝癌细胞株购自武汉诺普赛生物科技有限公司。

1.2 药物和试剂

细叶香茶菜购自安徽亳州药材市场，经鉴定为唇形科香茶菜属植物细叶香茶菜；低内毒素胎牛血清(FBS)RPMI1640培养基(Hyclone公司)；MTT(Sigma公司)；miR-429、FZD4基因引物(上海生工生物工程有限公司)；miR-429过表达载体(Invitrogen公司)；内切酶SacI和XbaI(美国NEB公司)；Western及IP细胞裂解液裂解液、清白蛋白(BSA)、显影液(Developer)(上海碧云天生物技术公司)；DAB试剂盒(DAB chromogenic kit)(南京建成生物工程研究所)。

1.3 仪器

Sartorius高速冷冻离心机(德国Sartorius-sigma公司)；JA2003分析天平(上海上平仪器公司)；DYY-6C型电泳仪(上海天能有限公司)；实时荧光定量PCR系统(杭州郎基科学仪器有限公司)；凝胶电泳图像处理系统(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 药物制备

精密称取细叶香茶菜乙酸乙酯部位粉末0.64 g加入0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液中同时滴加5滴吐温-80进行溶解，用0.5% CMC-Na溶液定容至1 000 mL；作为高剂量。用以上药物稀释制备中低剂量药物备用。

2.2 MTT法检测HepG2细胞增殖

将处于对数生长期的HepG2细胞(5×103个/mL)，接种于96孔板中，200 μL/孔，孵育(37 ℃，5% CO2)至单层铺满孔底时，倒掉原培养液。换液之后分别将200 μL质量浓度为0.04、0.16、0.64 g/L的乙酸乙酯部位药物接种至含有HepG2细胞的96孔板中。加入200 μL的0.5% CMC-Na溶液于含有HepG2细胞的96孔板中作为正常对照组(NC组)，每个剂量设5个复孔，孵育48 h后，置于倒置显微镜下观察。之后每孔加入10 μL的MTT溶液(5 g/L)，继续孵育4 h后小心吸去孔内培养上清液。在96孔板各孔再加入二甲基亚砜各150 μL，避光低速振荡10 min，至结晶物充分溶解且显色，用酶标仪测定吸光值(λ=490 nm)。

2.3 流式细胞仪Annexin VFITC/PI双标法检测细胞的凋亡

将HepG2细胞用不含EDTA的胰酶消化，将处于对数生长期的HepG2细胞(5×103个/mL)用不含EDTA的胰酶消化，接种于96孔板中，200 μL/孔，孵育(37 ℃，5% CO2)1 d，弃掉上清后，分别加入200 μL不同质量浓度的药物的完全培养基，4 h后PBS水冲洗后换完全培基置培养箱培养。培养48 h后消化(1 000 rmp/min，1 min)，PBS洗涤，AnnxinV结合缓冲液重悬细胞，吹打混匀，并用PBS稀释至约1×106个/mL；取100 μL上述细胞悬液加入5 μL Annxin V和100 μg/mL的PI工作液，37 ℃避光孵育15 min；之后加入400 μL Annxin V结合缓冲液，混匀后置于碎冰上，流式细胞仪对染色细胞进行分析，重复3次。计算凋亡率。

2.4 对HepG2细胞miR-429和FZD4表达的影响

2.4.1 RT-PCR检测miR-429和FZD4的表达 称取50 mg组织细胞，加Trizol，匀浆5 min；室温放置5 min后，加入200 μL的氯仿，震荡混匀40 s，室温放置15 min；然后6 ℃，10 000 rpm，离心15 min；用移液枪将水相转移到新的无酶EP管中，加入500 μL预冷的异丙醇，混匀，6 ℃，10 000 rpm，离心10 min后倒掉上清液，加入1 mL75%乙醇洗涤RNA沉淀。再次以6 ℃、7 500 rpm离心5 min后小心弃去上清液；室温干燥RNA胶状沉淀；加入50 μL无RNase的水，移液器吹打至沉淀完全溶解。取25 μL至新的EP管中，检测RNA的浓度和纯度，并进行琼脂糖凝胶电泳实验对RNA进行测定，确定总RNA浓度及纯度(OD260/OD280比值)。利用Nano-100微量核酸蛋白检测仪程序对RNA纯度浓度的进行测定。

所用引物序列为：miR-429(F)：ACACTCCAGCTGGGTAATACTGTCTGGTAA；(R)：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC；β-actin(F)：CCTCGCCT TTGCCGATCC(R)：GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC。按照上海翊圣生物科技有限公司的Hifair^®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix-试剂盒方法 RNA逆转录成DNA。将得到的含有cDNA的反转录反应液加入到下一步将要进行的反应体系内，然后按照每个样本进行5个目的基因的RT-PCR实验，每孔3次重复，每次1 μL模版。使用MonAmpTMChemoHS qPCR Mix(None Rox)进行实时荧光定量PCR检测。

2.4.2 Western blot检测FZD4蛋白表达蛋白的收集与裂解 不同浓度药物处理后48 h的HepG2细胞及对照组细胞弃培养基，用PBS(预冷)冲洗一遍，每孔内加入含1% PMSF的细胞蛋白裂解液100 μL，并使细胞刮勺彻底刮除贴壁细胞，4 ℃冰箱裂解30 min之后取上清液移至新的EP管。BCA法进行蛋白浓度的测定：按照实际和方法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳：本实验分离胶制备为12%的分离胶和5%的压缩胶。凝胶泳道中加双色预染蛋白Maker；上样后将电压设为低电压80 V。待Marker各色基本分离后接着加大电压为110 V，直至跑出自己所需要的条带后可停止电泳，电泳时间为70 min；然后转膜。转膜电压设定为110 V，时间75 min；转膜完立即将蛋白膜放置于1X TBS-T溶液中，清洗1～2 min，之后加Western封闭液(5%脱脂奶粉，溶于1X TBS-T溶液中)，37 ℃摇床缓慢摇动封闭1 h。弃去封闭液，TBS-T溶液洗膜1～2次，将PVDF膜封在塑料薄膜内，并加入用1X TBS-T来稀释的且按照1∶25 000倍稀释好的一抗(本实验选用β-actin抗体)。4 ℃缓慢摇动孵育1 h，每次洗膜10 min，共 3次。二抗(同样用1XTBS-T稀释且按照1∶25 000倍的比例)37 ℃摇动孵育1 h。再次洗涤5～10 min，共3次。最后将PVDF膜置于凝胶成像系统中，进行显影曝光。打开程序后，先让其温度冷却到零下30 ℃，取1 000 μL等体积的发光液Ⅰ和发光液Ⅱ混匀，将PVDF膜放在显影仪上，表面撒满发光液，运行软件，选择化学发光，设置曝光时间，进行5 s、10 s曝光拍摄。并利用Image软件进行蛋白条带灰度分析。

2.5 双荧光素酶活性测定检测miR-429和FZD4基因的靶向调控作用

采用microrna在线预测网站http://www.microrna.org/microrna/getGene Form.do对miR-429靶向FZD4的3′-UTR区域结合位点CAGUAUU进行分析。PCR扩增miR-429克隆基因3′-非编码区(3′-UTR)，经限制性内切酶 SacI和XbaI酶切后，将该片段插入pmirGLO双荧光素酶报告基因载体，构建野生质粒(WT)；再利用基因位点图片技术对结合位点的部分核苷酸进行突变，构建突变质粒(MUT)。重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定。在24孔板中接种正处于对数生长期的HepG2细胞(5×103个/mL)，汇合度在70%～80%时，脂质体LipofectamineTM2000共转染miR-429与报告基因质粒；每组设3个复孔，重复3次。转染6 h后进行换液处理，48 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒的具体操作步骤进行检测，单管型荧光检测仪进行测定。重复3次，独立试验后，进行统计分析。

2.6 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行统计处理，数据以(平均数±标准差)表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 MTT检测不同浓度药物对HepG2细胞的增殖

由图1可见在NC组中，HepG2细胞增殖较快，且高于其他不同浓度药物处理组；与NC组相比较，HepG2细胞的细胞活性随着乙酸乙酯部位药物浓度的不断升高而逐渐降低。各浓度组与NC组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

3.2 Annexin VFITC/PI双标法检测细叶香茶菜乙酸乙酯部位对HepG2细胞凋亡的影响

不同浓度药物作用HepG2细胞后，结果显示随着药物浓度的不断增加，凋亡率也随之升高。可见细叶香茶菜乙酸乙酯部位能够诱导HepG2细胞的凋亡。各浓度处理组与NC组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，并且差异与药物浓度呈正相关性。详见图1。

图1 不同浓度的细叶香茶菜乙酸乙酯部位对HepG2细胞存活和凋亡的影响

3.3 不同浓度组的细叶香茶菜对HepG2细胞miR-429和FZD4表达

RT-PCR检测不同浓度药物作用24 h后各组miR-429和FZD4的表达结果显示，不同浓度药物处理组与NC组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比较，miR-429相对表达水平随细叶香茶菜浓度的升高而升高；相反FZD4的相对表达水平随药物浓度的升高而逐渐降低；Western blot检测不同浓度药物作用24 h后各组FZD4表达灰度值比较差异具有统计学意义(P<0.05)，与NC组相比较，3组不同浓度的药物对FZD4相对蛋白表达量都随浓度的升高而逐渐降低(P<0.05)。详见图2。

图2 不同浓度的细叶香茶菜乙酸乙酯部位对HepG2细胞miR-429和FZD4表达的影响

3.4 上调miR-429表达抑制细胞增殖和促进细胞凋亡

miR-429转染HepG2细胞48 h后，与NC组相比，miR-con组miR-429相对表达水平、细胞活性以及细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)；而在miR-429组中miR-429相对表达水平以及细胞凋亡率显著升高，但细胞活性显著降低。详见图3。

图3 过表达miR-429抑制HepG2细胞增殖和诱导细胞凋亡

3.5 双荧光素酶活性测定验证miR-429靶向FZD4调控其表达结果

使用Starbase及TargetScan在线分析软件预测miR-429的下游靶基因，利用双荧光素酶报告基因检测miR-429与FZD4的靶向结合关系，结果显示，miR-429及FZD4 3′-UTR野生型及突变型载体共转染后，miR-429明显抑制了转染FZD4的3′-UTR野生型载体的细胞荧光素酶活性明显受到miR-429的抑制(P<0.05)，结果表明了miR-429能够直接靶向调控FZD4发挥其作用。另外，Western blot检测FZD4蛋白结果显示，上调miR-429表达之后，FZD4的表达明显受到抑制。结果表明，沉默FZD4表达抑制HepG2细胞增殖和诱导细胞凋亡miR-429能够促进HepG2细胞的凋亡，增强了HepG2细胞对细叶香茶菜提取物的敏感性，加入FZD4可抑制此作用，说明miR-429通过调控FZD4的表达介导HepG2细胞对细叶香茶菜的敏感性。详见图4。

图4 miR-429靶向FZD4调控其表达

3.6 沉默FZD4表达抑制肝癌HepG2细胞增殖和诱导细胞凋亡

与NC组相比较，si-con组细胞活性、细胞凋亡率以及FZD4蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，而si-FZD4组细胞活性、FZD4蛋白相对表达量显著降低，细胞凋亡率显著升高。沉默FZD4表达后，HepG2细胞的增殖凋亡趋势与上调miR-429表达结果相一致。详见图5。

图5 沉默FZD4表达抑制HepG2细胞增殖和诱导细胞凋亡

3.7 过表达FZD4逆转细叶香茶菜乙酸乙酯部位对肝癌HepG2细胞的抑制作用

与NC组相比较，sps、sps+pcDNA、sps+pcDNA+ FZD4组的细胞活性及FZD4蛋白相对表达量呈现逐渐上升的趋势；而细胞凋亡率则越来越低(P<0.05)。结果显示，过表达FZD4后能够逆转细叶香茶菜乙酸乙酯部位对肝癌的抑制作用。详见图6。

图6 过表达FZD4逆转细叶香茶菜乙酸乙酯部位对HepG2细胞的抑制作用

4 讨论

近年来miRNA逐渐被用来对肝癌调控机制的研究[12-17]，推测治疗肝癌的药物对HepG2细胞的生物学作用一定程度上受miR-429[18-20]的调控。基于生物信息学软件starbase的预测，拟将FZD4定为miR-429的下游靶基因。可以通过双荧光素报告基因实验验证miR-429可结合FZD4 3′-UTR并抑制其CDS区对目的蛋白的翻译从而实现对靶基因的调控。本研究中发现细叶香茶菜可抑制HepG2细胞增殖并促进其凋亡，且这种抑制作用与浓度呈正相关。将FZD4基因沉默以后发现HepG2细胞增殖受到抑制、凋亡率显著提高，这一结果与miR-429过表达后所得出的结论一致。通过观察细叶香茶菜对急性肝损伤小鼠及肝癌HepG2细胞的影响，结合分子生物学、细胞生物学等多种手段[21]，揭示了其在细胞内的调控机制，这些发现为探索肝癌的发病机理也提供了实验依据。