荧光猝灭体系测定谷胱甘肽

唐瑞韩,刘 丹,张心悦

（四川文理学院 化学化工学院,四川 达州635000）

由谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸合成的还原型谷胱甘肽（Glutatione,GSH）主要用于保护肝脏,帮助肝脏排毒,抑制脂肪肝的形成,改善因感染或中毒导致的肝炎.［1］由此可见,在临床上定性定量检测GSH 有重要意义.目前GSH 的检测主要有高效液相色谱法、［2］电化学分析法［3］等.荧光分光光度法［4］因为操作简单、使用方便、费用低而被广泛应用于离子测定及药物检测.7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸有发光团,可发射蓝色荧光,应用于生物检测.［5］具有内滤效应的MnO2纳米薄片可猝灭荧光,建立turn-off 体系.本论文拟采用荧光分析法,首次利用MnO2纳米薄片与7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸构造荧光信号turn-off 平台,用于定量测定GSH,建立一种测定GSH 的新方法.

1 实验仪器及方法

1.1 仪器和试剂

荧光分光光度计（日立F-2700）;高锰酸钾（批号:CAS 号7722-64-7）和硫酸锰（批号:HG3-1081-77）;谷 胱 甘 肽（ 还 原 型 ）（ 批 号:G105426-1g）和7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸（批号:D154333-1g）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;不同pH 值的柠檬酸钠－柠檬酸缓冲液（NaCA-CA）、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（PB）均为实验室自制.所有试剂除特别说明外均为分析纯,实验用水均为蒸馏水.

1.2 方法

1.2.1 MnO2纳米薄片的制备［6］

称 取0.0632gKMnO4、0.1014gMnO2溶 解 于适量蒸馏水中,在离心机上离心10min,用95%乙醇和水分别洗涤5 次,置于65℃烘干箱4h,取出黑色MnO2纳米薄片备用.在分析天平上称取MnO2纳米薄片0.0780g,用蒸馏水将其溶解并在50mL 容量瓶中定容.超声处理得到分散物.

1.2.2 7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸和MnO2荧光体系的建立

取0.5mL 1mmol/L 的7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸和0.2mL 1.56mg/mL 的MnO2于比色管定容至5mL,充分混合,常温静置10min,从而建立7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸-MnO2纳米猝灭体系.设置λex=400nm 进行测定,记录荧光强度.

1.2.3 测定还原型谷胱甘肽

在上述体系中加入不同量的GSH,在50℃水浴中反应40min,选取λex=400nm 作为激发波长进行测定,记录荧光变化量.

2 结果与讨论

2.1 复合体系的荧光光谱图

7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸因具有特殊的荧光发光团,当加入一定量的MnO2后荧光被猝灭,再加入一定量的GSH 后,荧光值逐渐增加,根据荧光信号的开关可用于定量检测GSH,见图1.向7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸-MnO2复合体系加入不同量的GSH,实验结果见图2.由图2 可知,GSH 的量在2-18nmol/mL 范围内与荧光恢复值具有良好的线性关系.

图1 不同物质的荧光光谱

a:7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸

b:7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸-MnO2复合体系

c:7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸-MnO2复合体系-谷胱甘肽

图2 GSH 的线性

2.2 最佳实验条件

2.2.1 MnO2的优化

取0.5ml40μg/mL 的香豆素,加入不同量的MnO2,实验结果见图3.从图3 中可看出,增加MnO2浓度,7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸的荧光值明显降低.本实验选取0.06mg/mL 时,达到最好的猝灭效果.

2.2.2 pH 的选择

本实验选择了BR、NaCA-CA 和PB 等缓冲试剂进行考察,测定其对GSH 检测体系的影响,最终选择PB 作为该体系的缓冲溶液,进一步确定了最佳pH 为6.3,实验结果如图4.

图3 MnO2猝灭香豆素的荧光优化

图4 反应体系的缓冲优化

2.2.3 最佳温度和反应时间

首先考察了最佳反应时间,实验结果表明该体系在40min 趋于稳定,同时考察了检测体系的温度灵敏度,由实验结果可知,本体系的最优反应温度为50℃,最优反应时间为40min

图5 反应体系温度和时间的优化

2.3 标准曲线的绘制

在最优实验条件下,加入的GSH 的浓度不一样,该体系的荧光恢复值不同,据此绘制其标准曲线,实验结果见表1.该体系线性方程为ΔF=236.5X+104.155,检出限为0.606nmol/mL,线性范围为2～18nmol/mL.

表1 标准曲线

2.4 方法的选择性和特异性

经实验考察,金属离子对该体系不会造成影响,多巴胺、抗坏血酸和其他氨基酸除半胱氨酸外,不会造成荧光恢复.

图6 金属离子和生物分子对该体系的响应

3 实际应用

将该方法运用于还原性GSH 片剂中GSH的测定,结果见表2,由实验结果可以得出该方法运用于GSH 片剂中的GSH 的测定,回收率在99.3%～100.5%,能较好地测定片剂中的GSH 含量.

表2 GSH片剂的分析

结 论

本论文构建了7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸产生荧光,MnO2加入后使得荧光发生猝灭的荧光信号turn-off 的复合体系,继续加入一定量的GSH,荧光强度将恢复,建立了荧光信号开关型检测体系,用于检测实际样品的谷胱甘肽的含量,效果较好.该方法灵敏度高,方便快捷.