基于TCGA数据库卵巢癌患者的miR-301b表达量与生存状况生物信息学分析

侯 娟，蒋树立，滕长财（滨州医学院附属医院，山东滨州 256603）

关键字：卵巢癌；miR-301b；抑癌因子;肿瘤基因图谱数据库

卵巢癌是女性中第五大致死的恶性肿瘤，截止2014年美国统计的新发病例为21 980 例，死亡人数为14 270 例，这其中90%为上皮性卵巢癌，而外科手术后联合顺铂和紫杉醇化疗的程序仍然是上皮性卵巢癌的标准治疗方法[1-2]。因此，发现并研究卵巢癌发病的分子特性对于提出更好更有效的治疗方法是必要的。

MicroRNAs 是一种可以调控基因表达的短的（～22nt）内源性的单链RNA 分子，成熟的miRNA和Argonaute 蛋白形成了RNA 诱导的沉默复合体（RISC），这种核糖核蛋白体的复合物调控了转录后基因的沉默，通过碱基配对的方式，miRNA 引导RISC 与信使RNA 结合，Ago 蛋白促使mRNA 降解或抑制其表达[3-4]。miRNA 的调控功能影响了细胞的信号通路，大部分这些通路控制着发育、细胞凋亡、增殖、分化和肿瘤的发展迁移等生理过程[5-6]。因此，干扰miRNA 的功能会影响到肿瘤的发生发展和治疗。

miR-301b 作为一种促癌因子已在多种癌症中被发现报道，如在胰腺癌中miR-301b 影响了转录因子的作用[7]，在三阴性乳腺癌和结肠癌中miR-301b出现高表达的结果[8]，在从巴雷特食管癌到食管腺癌的发展过程中，miR-301b 的表达量明显升高[9]，而在急性髓系白血病病人的血浆中miR-301b 出现高表达，化疗后表达量降低[10-11]。因此，对miR-301b 仍然不充分，为了进一步研究miR-301b 在卵巢癌中的作用，笔者用TCGA 数据库的基因表达数据进行分析。

1 材料与方法

1.1 数据来源 通过在线数据库获取公开的临床病例数据，并对临床病例中miR-301b 的相关数据进行统计分析；预测miR-301b 的靶基因并进一步分析其生物学功能。文章中所涉及的数据库见表1。478 例卵巢癌患者的临床信息以及miR-301b 的基因表达信息全部来源于TCGA 数据库,见表2。

表1 文章中应用到的数据库及软件

表2 478 例卵巢癌患者的临床资料特征

1.2 数据收集整理 分析TCGA 数据库中的478例卵巢癌患者的信息，miR-301b 进行单因素和多因素生存分析，判断其是否与预后相关。478 例卵巢癌患者的总生存期（OS）定义为从诊断到死亡的生存时间，随访时间0～180 个月，中位随访时间是40 个月，无疾病进展生存（disease free survival，DFS）指手术开始至局部复发或远处转移或最后一次随访的时间。将478 例卵巢癌患者的临床资料依年龄、美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC） 癌症临床分期、美国国家综合癌症网络（National Comprehensive CancerNetwork，NCCN）肿瘤分级、肿瘤病发位置、术后肿瘤残余等进行分类纳入生存分析。

1.3 统计学分析 采用Graphpad Prism5.0 软件和SPSS 21.0 软件进行统计分析和绘图。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用t 检验。生存分析采用Kaplan-Meier 法，Log-Rank 分析生存差异。运用Cox 比例风险回归模型分析卵巢癌患者的生存影响因素，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入数据的基本特征 在TCGA 网站获取478例卵巢癌患者的基因表达资料及临床资料，见表2。年龄按照中位数分为高年龄组（≥59 岁）和低年龄组（＜59 岁）；临床分期分为早期组（Ⅰ期+Ⅱ期）、晚期组（Ⅲ期+Ⅳ期）及未知；肿瘤等级分为低级别组（G1+G2）、高级别组（G3+G4）；病发位置分为单侧组、双侧组；肿瘤残余分为＜1.3cm 组和≥1.3cm 组；microRNA 按照表达量的中位数分为高表达组和低表达组。

2.2 单因素生存分析卵巢癌患者预后的影响因素见表3。对478 例卵巢癌患者的临床数据进行单因素总生存分析和无进展单因素生存分析，得出miR-301b 的高表达是卵巢癌患者总生存和无进展生存的保护因素,差异有统计学意义（P＜0.05）。高年龄组是卵巢癌患者总生存的危险因素，差异有统计学意义（P＜0.05），而AJCC 分期晚期组是无进展生存的危险因素，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 多因素回归分析卵巢癌预后的影响因素 见表4。以年龄（＜59 岁=0，≥59 发=1）、肿瘤等级（G1+G2=0，G3+G4=1）、病发位置（单侧=0，双侧=1）、临床分期（Ⅰ期+Ⅱ期=0，Ⅲ期+Ⅳ期=1，未知=2）、肿瘤残余（＜1.3cm=0，≥1.3cm=1）、miR-301b（ 低表达=0， 高表达=1）为自变量，以生存结局（生存=1，死亡=0）为因变量，Cox 回归分析显示，miR-301b 高表达是卵巢癌患者总生存和无病生存的独立影响因素，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 单因素分析478 卵巢癌患者预后因素与总生存和无进展生存的关系

表4 多因素Cox 回归分析478 卵巢癌患者预后因素与总生存和无进展的关系

2.4 miR-301b 靶基因及作用位点预测分析 通过在线数据库TargetScan, PicTar, miRanda 分别对miR-301b 进行靶基因的预测并得出预测结果，笔者在TargetScan 数据库中预测得到432 个靶基因，在miRanda 中预测得到7 900 个靶基因，在PicTar数据库得到469 个靶基因，综合三个数据库的预测结果，选择在三个数据库预测结果中均出现的靶基因，作为最终预测miR-301b 的靶基因。综合预测结果得到12 个靶基因。笔者发现miR-301b与靶基因的结合位点均位于其mRNA 的3’UTR 区，在3’UTR 区与靶基因结合后抑制靶基因的翻译，从而降低了靶基因的表达水平。笔者对这12 个靶基因进行生存分析发现，TEAD1 和CPEB4 的表达量与卵巢癌患者的预后相关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 Kaplan-Meier 分析miR-301b 的表达量与卵巢癌患者预后的关系

3 讨论

肿瘤的发生发展并不是由单一的基因突变引起的，它是多种突变长期累积的结果。卵巢癌作为一种致死性比较高的恶性肿瘤，它的发生发展及治疗过程受多种基因的影响，根据不同的分子表型会采用不同针对性的治疗方式。microRNA 作为一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，对细胞生长、组织分化、疾病过程起到重要的调控作用，尤其是肿瘤的发生发展。

miR-301b 作为一种对肿瘤具有重要作用的microRNA，在胰腺癌、肺癌等癌症中miR-301b 作为一种促癌因子[14]，促进胰腺癌和肺癌等疾病的进展，并且预后较差。笔者通过对TCGA 中卵巢癌的临床病例数据分析发现，miR-301b 高表达卵巢癌患者预后较好。miR-301b 在卵巢癌中表现出了抑癌基因的作用，与在胰腺癌、肺癌等癌症中原癌基因的作用相反[14]，笔者认为出现这种情况是由于不同的肿瘤具有不同的分子表型，即使相同的分子在不同的肿瘤中具有不同甚至相反的作用。正是由于肿瘤的这种特性，在治疗不同癌症时会采用不同的治疗手段，甚至相同部位的肿瘤会根据其分子分型的差异采取相应的治疗措施。通过本文对miR-301b 靶基因的分析及靶蛋白相互作用的预测发现，部分靶蛋白及相互作用蛋白是与肿瘤的发生发展及治疗具有重要意义的蛋白质。笔者对预测所得靶基因进行生存分析，发现TEAD1 与CPEB4 与卵巢癌的预后相关。先前研究发现在肝细胞癌和肾透明细胞癌中TEAD1 可以促进其癌细胞的增殖和转移，与笔者的生存分析结果一致，高表达TEAD1 是卵巢癌预后的危险因素[15-16]。研究报道在神经胶质母细胞瘤、神经胶质瘤中以及骨肉瘤中均发现CPEB4 可以促进癌细胞的增殖转移，同时发现CPEB4 在癌组织中的表达明显高于其对应的癌旁组织。这些研究与笔者数据分析的高表达CPEB4 卵巢癌患者预后差的结果相一致，CPEB4 属癌基因，其表达可以促进癌细胞的增殖，进而导致癌症患者预后较差[17-19]。

miR-301b 表达量的变化会直接影响到其多种靶蛋白的表达，在细胞的信号网络中，这些靶蛋白的变化会在细胞产生多种信号，并使细胞的生理过程，如细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、细胞间的行为关系等发生变化，这些变化可能会使细胞朝向癌变的方向发展。miR-301b 对于卵巢癌的发生发展具有重要的作用，miR-301b 的研究对卵巢癌的诊断治疗和预后评估具有重要的临床指导意义。