三种化学发光法检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗体试剂盒的临床应用评价

胡纪文，王恩运，阚丽娟，豆小文，赖柚霞，徐 莎，姜瑞伟，张秀明

(深圳市罗湖医院集团医学检验中心，广东深圳 518001)

新型冠状病毒的流行和传播已经成为影响世界各国的严重公共卫生事件，感染患者的“早发现、早隔离、早诊断、早治疗”对控制疫情蔓延至关重要。新型冠状病毒属于β 属的冠状病毒，其基因特征与急性呼吸综合征相关冠状病毒（severe acute respiratory syndrome-relatedcoronavirus，SARSr-CoV）和中东呼吸综合症冠状病毒（middle east respiratory syndrome-relatedcoronavirus，MERSr-CoV）有明显区别。有研究结果显示，新型冠状病毒与蝙蝠严重急性呼吸综合征样冠状病毒（bat-SLCoVZC45）同源性达85%以上[1-2]，国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组将其命名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒”（severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2）[3]，由 其 引发的疾病被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）正式命名为新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）。从 目前的认知来看，在毒性上，新型冠状病毒比SARS弱，而在传染性上，新型冠状病毒比SARS 更强。因新型冠状病毒潜伏期长，无症状感染者也存在传染性，且人群全部易感，因此研究快速且有效的实验室检测方法，对SARS-CoV-2 感染的筛查和诊断具有重要价值。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》明确将抗体检测结果纳入确诊病例的诊断标准，以及疑似病例的排除标准。如果疑似病例血清特异性IgM 和IgG 抗体阳性，IgG 抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期有4 倍及以上升高，则可以诊断其感染了新型冠状病毒。疑似病例的排除标准需要同时满足病毒核酸检测结果阴性以及发病7d 后新型冠状病毒IgM 和IgG 抗体仍为阴性两个条件[2]。化学发光免疫分析技术（chemiluminescence immunoassay，CLIA）检测新型冠状病毒血清IgM 和IgG 抗体具备高通量、方法稳定、安全性高、可以定量等特点而成为SARS-CoV-2 抗体检测的主要手段。自疫情暴发以来，国内已有多个厂家生产的新型冠状病毒血清IgM 和IgG 抗体化学发光检测试剂盒在临床上应用。本文评估比较了三个不同厂家化学发光法试剂盒对SARS-CoV-2 IgM 和IgG 抗体的检测性能，并探讨了抗体检测对新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的临床诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2020年1～4月深圳市已确诊的COVID-19 患者37 例为病例组，均为康复期患者，病程≥20 天；选取同期罗湖医院门诊和住院患者100 例作为对照组，核酸检测均为阴性，临床排除新型冠状病毒感染。动态观察1 例患者来自罗湖医院发热门诊。实验方案获得罗湖区人民医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器：实验仪器分别采用新产业全自动化学发光测定仪（Maglumi 800）、博奥塞斯Axceed260化学发光测定仪和亚辉龙iModules 化学发光测定仪。

1.2.2 试剂：三种SARS-CoV-2 抗体化学发光检测试剂盒分别为试剂A（IgM 批号：20200304；IgG批号：20200304）、试剂B（IgM 批号：G202004305；IgG 批号：G202004307）、试 剂C（IgM 批号：2722000202；IgG 批号：2722000201）。新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测试剂盒购自上海伯杰公司（批号：20200424C）。

1.3 方法

1.3.1 使用病毒采集管采集受试者鼻咽拭子标本，按照SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒说明书操作进行样本处理、核酸提取和PCR 扩增。

1.3.2 采集受试者3 ml 静脉血，置于含惰性分离胶的真空干燥管中，3 000 r/min 离心10 min 分离血清，检测SARS-CoV-2 抗体。所有操作严格按照仪器和试剂盒说明书进行，结果判读参照各试剂盒说明书。

1.4 统计学分析 运用GraphPad Prism 5 软件绘制ROC 曲线，试剂A 的临界值（Cut off 值）为S/CO ≥1 AU/ml，试 剂B 的Cut off 值 为≥1.0，试 剂C 的Cut off 值 为≥10 AU/ml；≥Cut off 值判定为阳性，＜Cut off 值判定为阴性，并计算灵敏度与特异度。采用SPSS22.0 软件进行数据统计和分析。一致性分析采用Kappa 一致性检验，0 ≤Kappa ≤0.2 为微弱一致性，0.2 ＜Kappa ≤0.4为弱一致性，0.4＜Kappa ≤0.6 为中度一致性，0.6＜Kappa ≤0.8 为高度一致性，0.8＜Kappa ≤1.0为极强一致性。

2 结果

2.1 三种化学发光新型冠状病毒抗体检测试剂盒的性能评估 采用37 例临床确诊的COVID-19 患者康复期血清样本和100 例对照组血清样本对三种不同厂家的化学发光新型冠状病毒抗体检测试剂盒进行评估，结果显示康复期COVID-19 患者血清IgM和IgG 水平显著高于对照组。对于IgM 抗体检测，除试剂C 外，试剂A 和试剂B 的AUC 值均大于0.9，表明试剂A 和试剂B 对于新型冠状病毒IgM 抗体检测具有非常好的检测性能，尤其是试剂B 性能最优，临床敏感度为56.76%，临床特异度为99%。对于IgG 抗体检测，三种试剂的AUC 值均大于0.9，均具有非常好的检测性能，三种试剂的临床特异度均为97.00%，而试剂C 的临床敏感度最高，为97.29%。见图1，图2，表1。

图1 三种化学发光试剂新型冠状病毒IgM 抗体检测性能

图2 三种化学发光试剂新型冠状病毒IgG 抗体检测性能

表1 三种新型冠状病毒化学发光试剂盒IgM 和IgG 抗体检测性能评估

2.2 三种化学发光试剂盒检测结果一致性评价 见表2，表3。利用Kappa 值对化学发光免疫分析法试剂A,B,C 的抗体检测结果一致性进行评价。结果显示，对于IgM 抗体检测，试剂A 与试剂B 的Kappa 值最高，为0.508，试剂C 与试剂B的Kappa 值最低，为0.065，提示试剂A 与试剂B IgM 检测结果具有中度一致性，试剂C 与试剂BIgM 检测结果仅具有微弱一致性。对于IgG 抗体检测，试剂A 与试剂C 的Kappa 值最高，为0.654，试剂A 与试剂B 的Kappa 值最低，为0.102，提示试剂A 与试剂C IgM 检测结果具有高度一致性，试剂A 与试剂B IgM 检测结果为弱一致性。

表2 三种化学发光试剂盒IgM 检测结果的一致性分析

表3 三种化学发光试剂盒IgG 检测结果的一致性分析

2.3 1 例患者新型冠状病毒抗体水平和核酸水平变化的动态观察 见表4。患者男性，32 岁，于2020年4月18日从武汉返回深圳，鼻咽拭子核酸检测阴性，未做抗体检测，在深圳某酒店隔离，隔离期间于24日再次采集鼻咽拭子核酸检测仍阴性，但特异性IgM 和IgG 抗体阳性（试剂B），结合流行病学史和有轻微流涕，以疑似病例收入我院隔离病区。入院第3 天，核酸检测仍为阴性，特异性IgM和IgG 抗体检测仍为阳性。入院第5 天，新型冠状病毒核酸检测呈现非常弱的阳性（ORF1ab 基因Ct值38.36，N 基因Ct 值37.51，Cut-off 值≤38），经深圳市CDC 二次采样咽拭子复核结果呈阳性。

表4 1 例新冠患者的抗体（S/CO）和核酸检测的动态观察

3 讨论

当人体受到新型冠状病毒感染时，免疫细胞会分泌产生特异性抗体。IgM 抗体在急性感染3～7 天后产生，可以反映机体是否处于急性感染早期；IgG 抗体在感染7 天左右开始产生，可作为诊断现症感染和既往感染的指标；IgM 和IgG 抗体联合检测可以监测患者整个疾病过程中的抗体表达水平，同时检测IgM 和IgG 抗体有助于提高检测的阳性率[4-6]。抗体检测可以作为核酸检测的重要补充，在临床诊断中也广泛使用。但是由于疫情突发，研制抗体检测试剂时间紧迫，导致临床所使用试剂检测性能存在较大差异，为此本研究对三种不同厂家的化学发光检测试剂盒进行了评估和比较，以期为抗体检测试剂的临床应用提供借鉴。

目前SARS-CoV-2 抗体检测试剂盒主要选择刺突糖蛋白（spike glycoprotein, S）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein, N）融合片段作为包被抗原，也有单独使用S 蛋白或N 蛋白作为包被抗原。S 蛋白是病毒感染人体细胞的武器[4]，针对S 蛋白受体结合区SRBD 蛋白的抗体具中和病毒的作用，采用SRBD 蛋白作为抗原检测到的IgG 抗体的出现并持续升高，应具有很好的预后及康复指示价值。SARS-CoV-2 N 蛋白与SARS 病毒N 蛋白有高度同源性[7]，N 蛋白是冠状病毒中产生最早且含量较多的蛋白质，具有较强的免疫原性和特异性，是抗体诊断材料的主要材料之一，由于N 蛋白抗体在发病10 天左右才开始大量产生，有研究认为N 蛋白抗体作为早期诊断指标可能存在一定的不足[8-9]。目前已有大量研究提示，不同种冠状病毒N蛋白或S蛋白存在免疫交叉反应。因此，SARS-CoV-2 抗体检测可受其他种类冠状病毒的影响，可能具有一定的假阳性率，但还需在临床检测中进一步证实[10]。本研究结果显示，三种试剂盒间的临床敏感度及一致性有较大的差异，主要原因是不同厂家试剂盒选择了不同的包被抗原以及采用不同的生产工艺，其中试剂A 采用S 蛋白与N 蛋白混合包被，试剂B采用S 蛋白包被，试剂C 采用S 蛋白与N 蛋白融合片段包被。除了包被抗原种类选择的不同，不同厂家选择的体外重组蛋白表达系统也有差异。体外重组蛋白表达系统主要包括真核表达系统和原核表达系统。其中原核表达系统以大肠埃希菌表达为主，真核表达系统包括哺乳动物细胞表达、酵母表达系统和昆虫表达系统，不同的表达系统对于抗体检测的敏感性和特异性也有影响。此外，针对抗体的不同检测方法（双抗原夹心法、间接法、捕获法等）的差异也会对试剂盒的敏感度、特异度产生影响。因此产品性能的标准化和产品工艺的标准化亟待解决。

病毒核酸检测作为诊断的“金标准”其特异度较其他方法学都高，但是目前的临床应用中发现其出现不少假阴性的结果，这意味着一些感染了病毒的患者会被漏诊，国外文献报道假阴性率为2%～18%，主要原因包括目前PCR 技术存在低拷贝数漏检问题、样本采集不当导致检测失败、样本提取过程因污染导致核酸降解[11-12]。而SARSCoV-2 特异性抗体可以作为核酸检测的重要补充，若疑似患者的核酸检测是阴性，可以对抗体进行连续监测，若抗体检测出现阳性，应引起临床的高度怀疑。在本研究中，动态观察1 例患者SARSCoV-2 抗体（IgM,IgG）的抗体水平和核酸水平变化，该患者在首诊和第3 天时核酸检测均为阴性，但是IgM 和IgG 抗体呈现双阳，且IgM 第3 天滴度比首诊高1倍，高度疑似新型冠状病毒感染。到第5天时，患者核酸检测转变为弱阳性，经过复核后最终确诊。研究结果提示，对于此类临床表现隐匿，且核酸水平非常低导致早期核酸检测结果呈现阴性的患者，血清抗体水平动态监测有助于新型冠状病毒感染的明确诊断，避免漏检。

采用化学发光法检测SARS-CoV-2 IgM 和IgG抗体有较高的敏感度和特异度，可以作为SARSCoV-2 筛查和诊断的有效手段[13。