两株对万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌的透射电镜下超微结构观察

张 晨，朱海平，金凤玲，孙虹佳，姚立琼

（兰州大学第一医院a.检验科；b.感染管理科,兰州 730000)

金黄色葡萄球菌是临床出现下呼吸道医院感染最常见的病原菌[1]，具有较强毒性，能够引起皮肤黏膜、肺部、心内膜、骨关节等部位的感染性疾病，严重时可以引起脓毒性休克及败血症等[2]。万古霉素自1958年应用于临床治疗革兰阳性球菌感染，1961年耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）出现后[3]，万古霉素更是成为治疗MRSA 所致感染的最后一道防线，也是为数不多的对多重耐药金黄色葡萄球菌有活性的药物之一。近年来随着MRSA 的迅速播散以及临床治疗中万古霉素的滥用，万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌开始出现，包括耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）、万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌（VISA）及异质性耐万古霉素金黄色葡萄球菌（h-VISA）[4]。1996年1月日本从一位MRSA 肺炎患者的痰液标本中分离出了首例h-VISA。同年，日本报道分离出第一株VISA[5]，而2002年美国更是出现了首例VRSA[6-7]，这引起了科学家的极大重视。2006年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)将万古霉素对金黄色葡萄球菌的折点更新为MIC ≤2 µg/ml 为敏感，4～8µg/ml 为中介，≥16µg/ml 为耐药。

本试验将前期基础试验中获得的一株VISA 和一株h-VISA 通过K-B 法、琼脂稀释法、菌谱分析法等进行复核，并对检出的两株耐药菌株进行透射电镜观察以了解其超微结构及耐药机制。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 试验菌株为课题前期试验中分离出的两株万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌，M1278 经鉴定为VISA，M1275 为h-VISA。金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923 购自甘肃省临床检验中心。

1.2 仪器与试剂 法国Bio-Merieux 公司生产的VITEK32 细菌鉴定系统及配套鉴定试卡、美国Thermo Fisher 公司的二氧化碳培养箱等。盐酸万古霉素生产企业为Eli Lilly Japan K.K，Seishin Laboratories，有效期内使用，使用前用ATCC25923进行质控；万古霉素(30µg) 药敏纸片由英国OXOID 公司生产。脑心浸液肉汤（BHI）产于法国Bio-Merieux 公司；琼脂粉为英国OXOID 公司产品。

1.3 方法

1.3.1 VISA 和h-VISA 的确认

1.3.1.1 K-B 法： 按照CLSI 推荐的K-B 法进行药敏试验, 采用MH 培养基，30µg 万古霉素药敏纸片，37℃ 孵育18 ～24h ,测量抑菌环直径。

1.3.1.2 琼脂稀释法：在MIC ≥4µg/ml 的BHI-万古霉素选择性培养基上如出现1 个以上菌落生长，经质谱鉴定确定为金黄色葡萄球菌菌株，可初步认定为可疑h-VISA。

1.3.1.3 可疑菌落菌谱分析法[8]：试验菌株M1278和M1275 在血平板上纯培养24h, 取M1278 和M1275 的纯培养菌落及标准菌株ATCC25923 用无菌生理盐水配制成1010CFU/ml，再连续进行10 倍稀释，配制成102～1010CFU/ml 的菌悬液。在含万古霉素4～64µg/ml 的万古霉素选择性培养基上点种每个浓度的菌液10µl，37 ℃ 孵育, 分别于24h 和48h进行菌落计数，并计算其相应的变异频率。变异频率=每块平板上生长的菌落数(CFU)/该平板所接种的细菌总量(CFU)。

1.3.2 耐药稳定性实验：取万古霉素选择性培养基上分离到的菌株,经鉴定为VISA 或h-VISA 后以常规方法接种于不含任何抗生素的MH 琼脂平板,持续传代9 代以上,再采用琼脂稀释法及E-test 法检测该菌株的MIC。

1.3.3 质量控制：为防止假阳性的出现，每次试验应使用金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923 作为对照，严格无菌操作，并用比浊仪准确控制菌悬液的浊度。

1.3.4 透射电镜标本制备过程：挑取血琼脂平板金黄色葡萄球菌标准株纯培养菌落作为正常对照组。菌落分别用2.5ml/dl 戊二醛固定,PBS 漂洗3次（每次10min），再经饿酸固定，系列浓度丙酮+乙醇梯度脱水（每个浓度脱水10min ），环氧树脂包埋、超薄切片、铅铀电子染色，透射电镜观察。

2 结果

2.1 K-B 法药敏试验结果 K-B 法药敏试验M1275和M1278 抑菌环直径均为6。

2.2 VISA 和h-VISA 检测结果

2.2.1 琼脂稀释法结果： 两株菌（M1275 和M1278）在含4µg/ml 的万古霉素选择性培养基上能够生长。

2.2.2 E-test 法复查MIC：用E-test 法对MIC 进行复查，M1275 和M1278 的MIC 均为4µg/ml。

2.2.3 万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌菌株菌谱分析：2 株菌均在万古霉素选择性培养基上有生长现象，结果见表1。

表1 2 株万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌菌株菌谱分析结果

根据HIRAMATSU的研究[5]，h-VISA 的 判断标准为：①金黄色葡萄球菌原代菌的MIC 在1～4µg/ml,而子代亚克隆在≥8µg/ml 的万古霉素选择性培养基上生长，且变异率≥10-6。②或是在含4µg/ml BHI-万古霉素选择性培养基上接种10µl 1010CFU/ml 菌悬液，孵育48 h，出现1 ～30个菌落则可能为h-VISA。③该亚克隆在不含万古霉素的培养基上连续传9 代耐药性不丢失[9-10]。通常h-VISA 的判断标准为①③，但是由于操作繁琐，工作量大，较难在临床实验室开展，因此HIRAMATSU 等[5]重新设计了h-VISA 的筛选方法，即②③。

由于本试验采用的是改良前的实验方去，所以要根据h-VISA 的判断标准①③来判定筛出菌株是否是h-VISA，两株菌M1275 和M1278 的原代MIC 都为4µg/ml，其子代也在≥8µg/ml 的万古霉素选择性培养基上能够生长，但是M1278的变异率只有10-8，达不到10-6，所以，M1278为万古霉素中介金黄色葡萄球菌（VISA），并可认为只有M1275 符合判断标准①③，判定为h-VISA。

2.3 电镜结果 见图1。

图1 电镜结果

3 讨论

万古霉素中介金黄色葡萄球菌(VISA)可分为同质性和异质性VISA。同质性VISA 是指对万古霉素MIC 在4 ～8µg/ml 的金黄色葡萄球菌，表现为所有细菌为单一万古霉素中介的群体，在无万古霉素的非选择性培养基上能够稳定传代二十代以上。异质性VISA（h-VISA）是指金黄色葡萄球菌含有耐万古霉素的子代，原代菌株对万古霉素MIC仅为1～2µg/ml，而对万古霉素 MIC ≥4µg/ml 的子代变异株可通过含4～6µg/ml 万古霉素的心脑浸液(BHI)选择琼脂筛选出来，其出现的频率是10-6或更高,该子代细胞亚群在无药培养基上连续传代9代以上仍能保持其耐药性不变。VISA 和h-VISA 统称为万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌。在前期实验过程中筛选出的2 株菌（M1275 和M1278）MIC 为4µg/ml,均为上述万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌。

万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌在电镜下的形态改变主要为细菌细胞壁增厚、表面凸起增多(见图1)。金黄色葡萄球菌细胞壁结构主要是肽聚糖，由氨基糖N-乙酰葡糖胺和 N-乙酰胞壁酸交替组成，在电子显微镜下观察细胞壁平均厚度约为20 ～40nm[11]。金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药机制目前尚不明确，但有研究认为可能与金黄色葡萄球菌细胞壁增厚密切相关。1997年，平松啓一教授研究团队首次报道了万古霉素敏感度减低的金黄色葡萄球菌VISA 菌Mu50 ( MICvan=8) 和 hVISA 菌Mu3( MICvan=3)[5,12]，并应用透射电子显微镜观察发现Mu50 细胞壁存在明显增厚的现象，达到对照菌株的2 倍[12]。本实验中M1278（VISA）的细胞壁厚度为(56.3±12.5)nm，较标准菌株ATCC25923的细胞壁厚度(12.5±12.5)nm 明显增厚，且达2 倍以上。M1275（h-VISA）的细胞壁厚度为(31.3±18.8)nm，也较标准菌株ATCC25923 的细胞壁明显增厚。

为进一步明确细胞壁增厚与金黄色葡萄菌对万古霉素低度耐药的相关性，随后有崔龍洙等[13]研究者收集到7 个国家的16 株VISA ，研究发现这16 株VISA 均出现了细胞壁增厚，且增厚程度与糖肽类抗生素的MIC 值密切相关，其相关系 数为0.908，与替考拉宁的相关系数为0.655。国内也有研究得出相类似的结论[14]。关于细胞壁增厚与金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药的关系目前认为可能有两种机制[15]：一种为“亲和诱捕”，普遍认为在增厚的细胞壁肽聚糖层上有大量D-丙氨酰-D-丙氨酸残基存在，这些残基与万古霉素有着较强的亲和力，可与大量万古霉素结合，导致大部分的万古霉素药物分子结合在细胞壁外层肽聚糖的残基上，而不能到达肽聚糖合成的活性部位，导致金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药；第二种是“阻塞现象”，万古霉素分子与金黄色葡萄球菌表面肽聚糖层上的D-丙氨酰-D-丙氨酸残基的结合，结合体阻塞了肽聚糖层的网孔，阻止了其它万古霉素分子继续向细胞内渗透到达靶位，继而导致金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药。

本次实验经透射电镜显示，M1275(h-VRSA)和M1278（VISA)与金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923 相比细胞壁明显增厚，证明h-VRSA和VISA 对万古霉素耐药很可能是由于细菌细胞壁增厚所引起的。但仍需进一步进行PCR 试验对两株菌进行万古霉素耐药基因的检测，以排除耐药是因获得万古霉素耐药基因所引起的可能性。前期实验中获得的VISA 和h-VISA 较少，可进一步对M1275(h-VISA)进行诱导，观察随着万古霉素诱导浓度和诱导时间的增加，h-VRSA 诱导株的MIC 和细胞壁厚度是否相应的增加，以验证本次电镜结果。