三种质谱仪测定血液环孢素A浓度性能确证和优选研究

王 磊,赵 颖,刘红星,2

（1.河北燕达陆道培医院,河北三河 065201；2.北京陆道培血液病研究院，北京 100176）

环孢素A（cyclosporine A,CsA）是由11 个氨基酸水合而成的亲脂性环状多肽，是一种具有高选择性的强效免疫抑制剂，为拮抗临床器官和组织移植后排异反应的首选药物[1]。在骨髓移植患者中，主要用于骨髓移植排异和移植物抗宿主反应（graft versus host reaction,GVHD）的预防和治疗[1-6]，其使用周期长，应用频率高，但其具有治疗窗窄，个体差异大，须进行血药浓度监测[2-7]。目前，CsA 血药浓度测定方法主要有免疫法（EIA，EMIT，MEIA，CMIA，Elecsys 等）、色谱法及质谱法[2-15]。由于免疫法易产生交叉反应，导致结果偏离，同时其试剂价格昂贵；色谱法分析时间长，限制了大样本的临床检测对血药浓度检测及时性的要求，因此质谱法检测CsA 血药浓度越来越受到广大实验室的 。因此，本文根据临床需求结合医院实际情况，在实验室现有三台不同型号质谱仪（TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD）上分别进行CsA 血药浓度测定的方法学性能确证[16-20]，找出CsA 血药浓度测定在实验室现有哪款质谱仪上性能更稳定，检测更方便，且更适合大批量临床样本检测。通过临床实际样本检测进一步确认同一批样本分别在三台质谱仪上检测结果之间差异是否有统计学意义，优选出合适的质谱仪用于CsA 血药浓度测定。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2019年11月24日～ 25日送河北燕达陆道培医院药理室检测CsA 血药浓度的新鲜剩余全血样本，共100 份。要求血样无黄疸、无乳糜、无溶血及凝血，样本剩余全血量不小于2ml。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 ：TRIPLE QUADTM 4500 MD 质 谱仪（美国Sciex 公司），Jasper 高效液相色谱仪，4000 Q TRAP质谱仪（美 国AB Sciex 公 司），岛津 20A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），API 3200 MD 质谱仪（美国AB sciex 公司），岛津Nexera Xp 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。其它仪器有涡旋振荡器，离心机等。

1.2.2 试 剂：ClinCal®-Calibrator（RECIPE，CHEMICALS+INSTRUMENTS GmbH)，ClinChek®-Control（RECIPE，CHEMICALS+INSTRUMENTS GmbH)；CsA 测定试剂盒（红细胞裂解液和CsA-d4 内标液及CsA 标准液；批号20191111，江苏豪思生物科技有限公司）。甲醇为色谱纯（Fisher）,水为屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏），甲酸为色谱纯（Fisher），乙酸铵（AR，MREDA TECHNOLOGY INC）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件：色谱柱Ultimate XB-C18 色谱柱（4.6mm×50mm，5µm），柱温60℃；流速0.8ml/min；流动相：2mmol/L 乙酸铵-0.1%甲酸水溶液（B）-0.1%甲酸甲醇溶液（A）。

表1 不同质谱仪上的色谱条件

1.3.2 质谱条件：采用电喷雾电离源（ESI+）； MRM；碰撞气：Medium。

表2 三台质谱仪的主要质谱参数

1.3.3 前处理方法：精密吸取100µl 全血置于1.5ml EP 管中，然后依次加入红细胞裂解液100µl，CsA-d4 内标液300µl，涡旋震荡1.0min，13 000r/min离心8min，取上清液150µl于自动进样器，待检。ClinCal®-Calibrator 和ClinChek®-Control 处理方法同上。

1.3.4 性能确证[16-20]

1.3.4.1 方法学考察：在上述色谱质谱条件下，取空白全血100µl，用300µl 的50%甲醇代替内标液，按照“1.3.3”项下处理；另取100µl 空白全血加一定量CsA 标准液，余下按照“1.3.3”项下处理；另取100µl 患者样品全血按照“1.3.3”项下处理方法处理。根据三组样品的出峰情况，对本实验的方法学进行考察。

1.3.4.2 标准曲线制备：分别在7 个1.5ml 的EP 管中加入100µl ClinCal®-Calibrator各系列校准工作液，按“1.3.3”处理后进行检测，用加权（W=1/X2）最小二乘法以CsA 峰面积与CsA-d4 峰面积比值为(Y)对CsA 浓度（X）进行线性回归，得CsA 标准曲线。以平均信噪比（S/N）为3 的浓度作为方法的最低检测线（limit of detection，LOD），以平均信噪比（S/N）为10 的浓度作为方法的最低定量线（limit of quantitation，LOQ）。

1.3.4.3 精密度和正确度：按“1.3.3”样品处理办法，对ClinChek®-Control 每一浓度平行制备6 个样本分析，连续测定3 天，根据测得结果计算日内及日间精密度和回收率。

1.3.4.4 残留和基质效应：通过分析高浓度样品或校准曲线最高点浓度样品后，立即测定空白样品来评价方法残留，测定空白基质样品中的CsA 和内标CsA-d4 的峰面积，以确认残留对CsA 准确定量的影响；基质效应是通过评价CsA 在有无全血基质中的信号值强弱来实现的，分别添加3 个浓度水平的CsA ClinChek®-Control 质控溶液到全血基质和纯溶剂，按照“1.3.3”样品处理办法处理，通过比较全血存在下CsA 及CsA-d4 的信号强度与不含全血CsA 及CsA-d4 的信号强度，通过内标归一化的基质因子(IS-normalized MF)来评价基质效应，计算公式如下：

IS-normalized MF =（基质存在下CsA 峰 面积/CsA-d4 面积）/（基质不存在下CsA 峰面积/CsA-d4 峰面积）

1.3.4.5 稳定性：由于CsA 血药浓度检测要求及时性，故对ClinChek®-Control 低、中、高浓度样品分别进行室温放置24h 后分析，4℃冰箱放置24h 后分析，每个浓度五份样品，按照“1.3.3”项下进行ClinChek®-Control 质控品处理。如果重复性测定的偏倚不超过±15%，则样品的稳定性符合实验室临床检测的要求。

1.4 统计学分析 收集的100 份患者CsA 血药浓度剩余全血样本，按“1.3.3”项下处理，分别在三台质谱仪上检测其CsA 浓度。使用SPSS 17.0 对三台仪器检测结果进行方差分析，以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。同时对三台仪器检测结果进行相关性分析。

2 结果

2.1 方法学考察结果 见图1。在选用条件下，全血中内源性物质不干扰CsA 和CsA-d4 的测定，CsA 在TRIPLE QUADTM 4500 MD，4000 Q TRAP和API 3200 MD出峰时间分别为1.95，1.95 和1.99min，各峰型良好，CsA-d4 与CsA 保持一致。TRIPLE QUADTM 4500 MD 和4000 Q TRAP 每针检测时间为3min；API 3200 MD 每针检测时间为4min，耗时较长，检测速度慢。

图1 方法学考察（A，B，C）

2.2 标准曲线 见表3。表明CsA 在浓度区间（26.4 ng/ml ～ 1 290 ng/ml）内，在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 质谱仪上的线性关系良好，均可用于定量；其LOD 分别为0.5，0.2，0.6 ng/ml；其LQD 分别为1.7，0.7，2.1 ng/ml。

表3 不同型号质谱仪标准曲线结果

2.3 精密度和准确度 见表4。CsA 在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD上的相对标准偏差均较小（＜5%），精密度好，回收率高(＞90%)，准确度好。说明此三台质谱仪上的CsA 检测方法均能满足患者CsA 血药浓度监测对精密度和准确度的要求。

表4 三台质谱仪精密度与准确度结果

2.4 残留、基质响应结果 残留结果见表5，CsA和 内 标CsA-d4 在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 三台质谱仪上残留结果均小于5%，符合中国药典药品生物样品定量分析方法验证指导原则[16]。

基质效应结果见表6，表明有全血、无全血基质中加入不同浓度CsA 在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 三 台 质 谱 仪上的IS-normalized MF 分别为94.96%～ 106.02%，88.96% ～ 95.47%和99.14%～ 107.82%，偏倚（CV）均小于15%，说明内标与分析物的基质效应接近，可以补偿样品中分析物可能出现的基质效应，基质效应评价符合中国药典药品质量标准分析方法验证指导原则[16]。

表5 三台质谱仪残留结果

表6 三台质谱仪基质效应结果（%）

2.5 稳定性结果 低、中、高浓度质控品分别进行室温放置24h，4℃冰箱放置24h 稳定性实验（n=5），在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 三台质谱仪上重复测定的偏倚(CV)均小于15%，稳定性数据符合要求；但根据实验数据可知，样本4℃冰箱放置其结果偏倚更小，更稳定，在实际操作中更可行。

表7 三台质谱仪稳定性结果（n=5）

2.6 临床应用 随机收集2019年11月24日～25日的环孢素样本100 份，并分别在三台质谱仪上进行检测，其中CsA 血药浓度结果小于100 的占比58%，结果大于100 并小于300 的占比42%。其方差分析结果为F=0.409，P=0.665＞0.05，说明TRIPLE QUADTM4500 MD 与4000 Q TRAP，API 3200 MD 三种方法检测结果差异均无统计学意义。同时，TRIPLE QUADTM4500 MD 与4000 Q TRAP相关系数为0.994 0，4000 Q TRAP 与API 3200 MD样本结果相关系数为0.996 9，TRIPLE QUADTM4500 MD 与API 3200 MD 相关系数为0.995 9,说明三台质谱仪检测结果相关性较好，无需换算可直接进行互相转换，供临床参考。见图2。

图2 相关性分析

3 讨论

CsA 作为环状多肽类免疫抑制剂，主要用于临床GVHD 的预防和治疗。由于其分子量较大，代谢产物种类较多，且代谢产物含量各异[1-11]。因此，其血药浓度受不同检测方法影响较大[2-5,7-10]。用免疫法检测，其代谢产物和结构类似物容易与CsA 发生免疫交叉反应，导致CsA 血药浓度检测结果偏高或偏低；同时又由于CsA 代谢产物活性不同，导致CsA 血药浓度结果与临床现象不符，对CsA 血药浓度监测，方法的选择就显得尤为重要。DAVID W.Holt等[11]人认为色谱法作为CsA 血药浓度测定的金标准，质谱检测具有更高的灵敏度和选择性。2002年澳大利亚的专家共识指出CsA 血药浓度测定可以选择免疫法（EMIT，ACMIA）或者是色谱法和质谱法，同时指出随着质谱仪的普及，质谱法检测CsA血药浓度将成为趋势[12]。2009年WHO 指出CsA血药浓度测定应选择特异性强的检测方法，避免代谢产物的干扰[13]。同时西雅图标准中也指出CsA血药浓度选择高效液相色谱串联质谱测定且梅奥诊所也采用高效液相色谱串联质谱来测定免疫抑制剂的血药浓度[14]。2019年，中国治疗药物监测专家共识指出，从药物专属性上推荐采用液相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱技术用于药物血药浓度测定[15]。本文选择质谱法检测CsA 血药浓度，是基于色谱法作为CsA 血药浓度监测的金标准而进行的，通过确定的质量数特异性监测CsA，进而定量，其不受代谢产物和结构类似物的干扰，用于检测CsA 母体药物。

由于本实验拥有三台质谱仪（TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAPAPI 与3200 MD），不同仪器间用于检测骨髓移植患者CsA 血药浓度是否存在差异以及哪台仪器更适合的问题，一直困扰实验室。本试验主要对以上三种不同型号质谱仪进行CsA 血药浓度进行性能验证，以明确哪一种型号质谱仪更加适合CsA 血药浓度监测，主要通过标准曲线，日内、日间精密度，残留，基质效应，稳定性这几方面进行验证[15-20]。有以上结果可见，API 3200 MD 检测时间长，进样量大，质谱仪易受污染。本实验室前期预实验也发现API 3200 MD 对色谱梯度洗脱方法要求很严格，其影响检测稳定性因素较多。而TRIPLE QUADTM 4500 MD 与4000 Q TRAP 检测时间短，进样量小，其方法较稳定。但由于其价格较高，尚不能广泛使用。而API 3200 MD 和TRIPLE QUADTM4500 MD均获得CFDA批准，可以用于临床实验室检测。整体结果表明TRIPLE QUADTM4500 MD 与4000 Q TRAP 和API 3200 MD 相比，更适合于CsA 血药浓度监测。希望基于本试验的结果对临床如何选择质谱仪监测CsA 血药浓度提供参考，以便更好地实现个体化、合理化用药[2-5,9-12]。