帕罗西汀片对抑郁症大鼠模型抑郁行为的改善效果及相关作用机制分析

刘新黎 陈家俊 胡浩宇 金岗生 徐宾 戴炜鹏 胡娅娜 冯炯 陈衍 谢青潇

[摘要] 目的 分析帕羅西汀片对改善抑郁症大鼠模型抑郁行为的效果，同时对相关作用机制进行探讨。 方法 选取健康雄性SD大鼠63只，并随机分为参照组（n=21）、试验组（n=21）及模型组（n=21）。正常饲养参照组大鼠，试验组大鼠及模型组大鼠在孤养及慢性轻度不可预见刺激条件下进行抑郁症大鼠模型构建，模型建立期间对试验组大鼠实施帕罗西汀灌胃操作，对模型组及参照组大鼠实施0.9% NaCl灌胃操作，分析帕罗西汀片对抑郁症大鼠自主活动次数、不动时间、记忆能力及学习能力大鼠海马CA3区TrkB、BDNF蛋白表达产生的影响。 结果 试验组大鼠自主活动次数明显较模型组多，试验组及模型组大鼠自主活动次数均明显少于参照组大鼠，差异有统计学意义（P<0.05）。Morris水迷宫定位航行实验结果显示，试验组大鼠潜伏期第1～4天均明显短于模型组，试验组、模型组Morris水迷宫空间探索实验穿台次数明显多于参照组，差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组化染色结果表明大鼠海马CA3区BDNF蛋白阳性着色为棕褐色，TrkB着色亦为棕褐色，与参照组及试验组相比，模型组阳性着色明显减少且染色强度明显下降。模型组大鼠TrkB及BDNF蛋白阳性细胞占比均显著低于参照组及试验组（P<0.05）;试验组大鼠TrkB及BDNF蛋白阳性细胞占比较参照组低，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 帕罗西汀片能够使抑郁症大鼠抑郁症状得到明显改善，同时还能使大鼠记忆能力以及学习能力得到提高，作用机制与海马CA3区TrkB及BDNF蛋白表达获得上调存在一定的相关性。

[关键词] 帕罗西汀片;抑郁症大鼠模型;抑郁行为;改善效果;作用机制

[中图分类号] R971          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）19-0033-04

Ameliorative efficacy of paroxetine tablets against depressive behavior in depression rat models and the mechanism behind it

LIU Xinli   CHEN Jiajun   HU Haoyu   JIN Gangsheng   XU Bin   DAI Weipeng   HU Ya'na   FENG Jiong

CHEN Yan   XIE Qingxiao

Department of Encephalopathy （Neurology）， Jinhua Hospital of Traditional Chinese Medicine in Zhejiang Province， Jinhua   321017， China

[Abstract] Objective To analyze the ameliorative effects of paroxetine tablets on depressive behavior in depression rat models and explore the relevant mechanism. Methods Sixty-three healthy male Sprague-Dawley（SD） rats were randomly divided into the control group（n=21）， the test group（n=21） and the model group（n=21）. Rats in the control group were normally housed， and those in the test and model groups were housed individually under chronic unpredictable mild stress（CUMS） to establish depression rat models. Rats in the test group were intragastrically administered with paroxetine during the establishment of the depression model， and those in the control and model groups were merely intragastrically administered with 0.9% NaCl. Effects of paroxetine on locomotor activity， freezing time， memory and learning ability， and the protein expressions of brain-derived neurotrophic factor（BDNF） and its receptor TrkB in the CA3 hippocampus in depression rats were analyzed. Results The locomotor activity significantly increased in the test group compared with the model group， and it significantly decreased in the test and model groups compared with the control group， with statistically significant differences（P<0.05）.In the Morris water maze（MMM） trials， the test group showed a shorter latency than the model group from Day 1 to Day 4. The test and model groups presented more platform-crossing numbers than the control group， with statistically significant differences（P<0.05）. Immumohistochemical staining showed that BDNF-positive neurons （brown） and TrkB-positive neurons （brown） in the CA3 region significantly decreased with lower staining intensity in the model group compared with the control and test groups. Proportions of both TrkB- and BDNF-positive neurons in the model group were lower that those in the control and test groups（P<0.05）. Proportions of TrkB-and BDNF-positive neurons in the test group were lower than those in the control group， with statistically significant differences（P<0.05）. Conclusion Paroxetine tablets significantly improved depressive behavior in depression rats with enhanced memory and learning ability. This effect perhaps associated with the up-regulations of TrkB and BDNF in the CA3 hippocampus.

[Key words] Paroxetine tablets; Depression rat model; Depressive behavior; Ameliorative efficacy; Mechanism

近年来由于人们生活及工作压力不断加大，抑郁症发病率不断升高，对广大患者的正常生活造成干扰，部分病情严重患者容易出现自残及自杀倾向，生命安全受到极大的威胁[1-2]。帕罗西汀片属于临床应用较广的一线抗抑郁药物，该药物为选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，对于改善患者抑郁情绪能够发挥一定的作用[3]。建立理想的实验动物模型能够为临床深入研究和探析抑郁症机制并为临床用药提供重要参考。评价情感障碍类实验动物模型是否成功需要自临床症状、致病原因、生理与病理改变和药品反应灵敏性等方面进行评价，同时还能够为临床评价药物效果及作用提供实验基础。此次研究旨在探讨帕罗西汀片对改善抑郁症大鼠模型抑郁行为的效果以及相关作用机制，研究时间为2018年10～12月，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选取健康雄性SD大鼠63只，体重为200～230 g，周龄均为8～10周，平均（8.57±0.21）周，实验大鼠动物许可证号：SCKK（粤）2018-0002，购于广东省医学实验中心，动物于无特定病原菌（SPF）环境饲养，每笼4～5只、湿度50%～60%、温度为22℃～25℃，可自由获取饮水以及食物，纯合子交配繁殖。此次研究获得动物管理和使用委员会批准，于动物达到试验环境后对其生长活动情况进行密切观察。

1.2 仪器试剂

本研究所用盐酸帕罗西汀片产自北京万生药业有限责任公司，国药准字：H20133084，产品编号：A14202576983。酪氨酸激酶受体B（TrkB）及脑源性神经营养因子（BDNF）购自英国Abcam公司。所用仪器包括CX光学显微镜、大鼠Morris水迷宫以及Image Pro Plus 6.0图像分析软件、ZH-LUO/80小鼠自主活动仪。

1.3 分组及用药方法

选取健康雄性SD大鼠63只并实施随机分组，主要包括参照组（n=21）、试验组（n=21）及模型组（n=21）。正常饲养参照组大鼠，试验组大鼠及模型组大鼠在孤养及慢性轻度不可预见刺激条件下进行抑郁症大鼠模型构建，连续3周对大鼠进行如下应激：禁水、进食、放置碎布片等陌生异常物品;散发陌生异常气味;合笼饲养;倾斜笼子（45°）;照明过夜;间歇给予85 dB噪音;潮湿垫料;闪光刺激。每日选择1～2种刺激且避免同种刺激连续出现。模型建立期间，对试验组大鼠实施帕罗西汀灌胃操作，将帕罗西汀片与纯水混合后实施灌胃操作，帕罗西汀片应用剂量为1.8 mg/kg，纯水应用量为1 mL/100 g，灌注频率4次/d，连续灌胃3周。对模型组及参照组大鼠实施0.9% NaCl灌胃操作，灌注量为1 mL/100 g，4次/d，连续灌胃3周。模型组大鼠存在明显的抑郁症状，主要包括毛色晦暗、兴趣减退、食欲不振、体重减轻、探索行为减少等。通过指标检测以及行为学检测等模型组大鼠表现出精神运动性抑制、兴趣減退以及快感缺失等与人类抑郁症患者常见行为相似的特征及皮毛光泽暗淡等现象且上述行为持续时间较长，表明抑郁症大鼠模型造模成功，能够作为抑郁症模型进行相关研究[4]。

1.4 检测大鼠抑郁行为变化情况

结束用药后应用Open-field实验对大鼠抑郁行为变化情况进行检测，场地底部为黑色且环境安静，于每天相同时间段内开展试验，提小鼠尾巴将之放入中心方格，观察4 min内大鼠垂直竖立次数及水平运动格数并进行准确记录，自主活动次数=垂直得分+水平得分，同时记录大鼠不动时间[5]。

1.5 检测大鼠记忆功能及学习功能

干预结束后应用Morris水迷宫测试系统[6]对大鼠记忆功能及学习功能进行检测，分别对三组大鼠进行空间探索实验及定位航行实验。水迷宫为高50 cm、直径170 cm圆形水池，内置安全岛平台，高度为29 cm、直径12 cm，进行实验前小鼠需提前适应环境，游泳训练后60 s内找到平台，训练成功后于造模前后进行测试，持续测试4 d并记录大鼠找到平台时间。

1.6 检测大鼠海马CA3区TrkB、BDNF蛋白表达情况

完成Morris水迷宫测试后应用Wsetern-blot方法进行TrkB、BDNF蛋白检测，将500 μL裂解液加入收集好细胞的EP管中，应用超声匀浆机进行匀浆操作，然后于4℃冰箱内放置一夜，通过电转移方式转移至硝酸纤维素膜上，然后加入1：300稀释兔抗人p-TrkB及TrkB多克隆抗体，于4℃条件下孵育过夜。将1：2000稀释羊抗兔碱性磷酸酶标记二抗加入，于室温下孵育下持续孵育2 h，将膜取出并加入碱性磷酸酶显色剂，于10～30 min后进行蛋白表达检测，应用分析软件计算海马区CA3区TrkB、BDNF蛋白阳性细胞所占百分比[7]。

1.7 统计学处理

应用SPSS21.0统计学软件包进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间计量资料比较采用方差分析，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 帕罗西汀片对抑郁症大鼠自主活动次数、不动时间产生的影响比较

试验组大鼠自主活动次数明显多于模型组（P<0.05），试验组及模型组大鼠自主活动次数均明显少于参照组大鼠（P<0.05）。模型组大鼠不动时间明显较参照组及试验组长（P<0.05），试验组大鼠不动时间明显长于参照组大鼠（P<0.05）。见表1。

2.2 三组大鼠潜伏期及穿台次数比较

Morris水迷宫定位航行实验结果显示，模型组大鼠潜伏期第1～4天均明显长于参照组（P<0.05），试验组大鼠均明显短于模型组（P<0.05）。模型组Morris水迷宫空间探索实验穿台次数明显少于参照组（P<0.05），试验组穿台次数明显多于参照组（P<0.05）。见表2。

2.3 帕罗西汀片对抑郁症大鼠海马CA3区TrkB、BDNF蛋白表达产生的影响分析

采用免疫组化染色观察大鼠海马CA3区TrkB、BDNF蛋白表达情况，光学显微镜下进行观察并采用Image-Pro Plus 多功能真彩色细胞图像分析管理系统分析图像数据，研究结果表明大鼠海马CA3区BDNF蛋白阳性着色为棕褐色，TrkB着色亦为棕褐色，与参照组及试验组相比，模型组阳性着色明显减少且染色强度明显下降，见封三图4。模型组大鼠TrkB及BDNF蛋白阳性细胞占比均显著低于参照组及试验组（P<0.05）;试验组大鼠TrkB及BDNF蛋白阳性细胞占比较参照组低（P<0.05）。见表3。

3 讨论

抑郁症属于临床发病率较高的精神心理疾病，对人类身心健康造成极大的损害，临床症状主要表现为行为迟缓、表情呆滞、记忆力衰退、失眠、心悸、头晕、精神不振、情绪不宁等，可表现出面色晦暗、脱发、食量异常、体重下降等躯体症状以及喜怒无常、易怒急躁等精神症状，具有病情复发率高、致残率高以及自杀率高等特点[8-9]。患者容易伴发躁狂症状且出现双向障碍的可能性较高，一旦患病会导致患者付出极高的经济、社会以及感情等代价，不但会降低患者的生活品质、威胁其生命安全，同时也会影响患者家庭和谐以及社会稳定[10]。当前，随着工作压力及生活压力不断加重，抑郁症发病率不断升高且呈现出日益年轻化的特点，因此，加强抑郁症筛查和诊疗对于改善患者生命健康有重要价值。

BDNF为分布于大脑皮质及海马部位的蛋白，与记忆形成存在密切关联，可与受体TrkB结合并在神经元生长、发育及分化过程中发挥重要作用，对神经可塑性以及神经元网络形成均可产生重要影响，可发挥理想的抗抑郁作用[11-13]。BDNF能够使运动神经元存活以及功能得到有效维持，能够促进中枢神经系统神经细胞合成，此外，对神经细胞损伤修复以及生长发育均可产生促进作用，BDNF高表达作用主要体现于海马区及皮层部位，抑郁症患者额前叶及海马部位BDNF水平低于常人[14-15]。

海马为记忆、学习以及情绪的综合认知体，一旦发生强烈和长期应激极易导致海马区神经数目减少并造成海马受损，进而使得海马体积缩小、神经元缺失[16-18]。不同应激状态对海马可产生不同的影响，慢性温和应激可导致海马组织结构发生器质性变化，急性应激则无法使海马形态结构发生变化[19-20]。此次研究中，试验组大鼠自主活动次数明显较模型组多，模型组大鼠不动时间明显较参照组及试验组长，试验组大鼠不动时间明显长于参照组大鼠。模型组大鼠Morris水迷宫定位航行实验结果显示潜伏期第1～4天均明显长于参照组，试验组大鼠均明显短于模型组。模型组Morris水迷宫空间探索实验穿台次数明显少于参照组，试验组穿台次数明显多于参照组。模型组大鼠TrkB及BDNF蛋白阳性细胞占比均显著低于参照组及试验组，试验组大鼠TrkB及BDNF蛋白阳性细胞占比较参照组低，提示BDNF与其受体缺失及海马神经元萎缩、凋亡等存在关联，并易诱发抑郁症。此外，帕罗西汀片还能够对海马CA3区BDNF与受体TrkB蛋白产生调节作用，从而能够取得抑郁症改善效果[21]。

综上所述，帕罗西汀片能够有效改善抑郁症大鼠抑郁症状，同时还有助于提高大鼠记忆能力及学习能力，作用机制可能与该药物能够对海马CA3区TrkB及BDNF蛋白表达发挥上调作用等相关。

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（收稿日期：2019-10-18）