苦荞麸皮总黄酮体外抗氧化活性及体内解酒护肝作用

童钰琴,李 姝,牛曼思,王松涛,杨雪琴,孙 琴4,,*,冉茂芳

(1.西南医科大学药学院,四川泸州 646000;2.泸州品创科技有限公司,四川泸州 646000;3.四川大学生命科学学院资源微生物学及生物技术教育部重点实验室,四川成都 610064;4.西南医科大学附属中医医院中西医结合药物研究中心,四川泸州 646000)

苦荞麦(Tartary buckwheat),学名鞑靼荞麦(Fagopyrumtataricum(L.)Gaerth),是廖科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrom)的一种营养价值丰富的药食两用粮食作物[1]。苦荞在中国有着悠久的食用历史,《本草纲目》中记载其有益气力、续精神、利耳目、降气宽肠、健胃的作用。苦荞麦中除了含有蛋白质、碳水化合物、矿物质及维生素等丰富的营养成分外,还含有黄酮类、酚酸、单宁、植物甾醇等生物活性物质[2]。

中国有悠久的酿酒历史和内涵丰富的酒文化,酒作为人们日常生活中的一种重要饮品,正逐渐成为各种社交及情感沟通的媒介[3]。近年来虽然欧洲国家的酒精性饮料消费量略有下降,但包括中国在内的其他国家销量仍呈现上涨趋势,因过度饮酒所带来的个人健康及全球公共卫生问题也受到广泛的关注[4-5]。正常情况下,自由基及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)都是机体的正常代谢物,机体也处于氧化还原的动态平衡中,因而理性适量的饮酒不会对身体造成严重损害;但是长期大量的饮酒则会破坏机体的氧化还原平衡,引起机体的氧化损伤,造成机体生理功能的紊乱[6-7]。过度饮酒严重时还会造成酒精性肝损伤,进而引发酒精性肝炎、肝脏脂肪变性、肝硬化、肝癌等病理性疾病,对机体健康造成威胁[8-9]。因此,解酒护肝产品的研究与开发也逐渐受到了社会各界的重视。

目前市面上的解酒产品多以古方中的中草药结合现代化的手段来进行开发,这些产品以其低毒副作用等优势成为市场上的主流产品,但同时也存在活性成分不明确等问题[10]。近年来的研究表明,膳食中含有的活性物质如黄酮、白藜芦醇、皂苷、多糖和β-胡萝卜素等,可通过抗氧化、抗炎、促凋亡等多种机制对酒精造成的肝损伤产生保护作用[11-12]。作为植物中普遍存在的一类天然化合物,黄酮类物质具有广泛的生理活性,相关研究也显示黄酮类物质如葛根总黄酮、荷叶总黄酮等具有良好的解酒护肝功效[13-14]。苦荞黄酮是苦荞中主要的功能活性物质,具有降低血糖、调节血脂、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性,也具有抗动脉粥样硬化、预防老年痴呆等疾病的作用[15]。然而,目前国内外关于TFTB解酒护肝的研究报道内容较少。

本文就TFTB的体外抗氧化活性、解酒功能及对醉酒小鼠肝损伤的保护作用开展研究,以期为TFTB作为解酒功能性食品及解酒药物的开发研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级KM小鼠 4～5周龄,体重18～22 g,雄性,由西南医科大学实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(川)2018-17,小鼠于实验前7 d购进,并进行适应性喂养。动物房内光线充足,通风良好,室内温度(26±1) ℃,相对湿度为45%～50%,小鼠饲喂维持饲料,饮用一级动物饮水,在饲喂期间小鼠自由进食、饮水;苦荞麸皮总黄酮(Total Flavonoids from Tartary Buckwheat Bran,TFTB) 总黄酮含量70.83%,实验室自制;儿茶素、表儿茶素、牡荆素、芦丁、杨梅素、山奈酚-3-O芸香糖苷、槲皮素、山奈酚标准品(纯度均≥98%) 成都普思生物科技股份有限公司;甲醇、磷酸(色谱纯) Knowles;净品级ADS-7型大孔吸附树脂 天津浩聚树脂科技有限公司;磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水乙醇、冰乙酸、盐酸、α-萘乙二胺盐、羧甲基纤维素钠(Carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na) 分析纯,成都市科隆化学品有限公司;维生素C(L-ascorbic acid,VC)、对氨基苯磺酸 上海阿拉丁试剂公司;邻苯三酚、亚硝酸钠 分析纯,国药化学试剂公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,DPPH) Sigma公司;38%vol浓香型白酒 泸州老窖股份有限公司;联苯双酯 北京协和制药厂;谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)试剂盒、总超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)试剂盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒、蛋白定量试剂盒 南京建成生物工程有限公司。

ME20A型万分之一天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;LC-16型高效液相色谱仪 日本岛津公司;DHG-9245A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;SP-756P型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;5804R型台式高速离心机 艾本德中国有限公司;Flex Station 3型酶标仪 美谷分子仪器有限公司;DZKW-D-4恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司;MT-30K型自动匀浆器 北京中兴伟业仪器有限公司;WH-861型涡旋混合器 太仓市华利达实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 TFTB的制备方法 取苦荞麸皮适量,加入10倍量的70%食品级乙醇在60 ℃下热回流提取3次,每次3 h,合并3次提取液,减压浓缩至干,得苦荞麸皮黄酮粗品。以苦荞麸皮黄酮粗品加适量水样品作为上样液,通过ADS-7型大孔吸附树脂进行动态吸附,再用90%乙醇洗脱,收集洗脱液减压浓缩至干,即得TFTB样品。

1.2.2 TFTB黄酮组分及含量测定 参照高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)[16]测定,取TFTB样品适量,甲醇充分溶解后,用0.22 μm微孔滤膜过滤,HPLC进行检测,检测条件为:色谱柱为Intersustain C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速1.0 mL/min,柱温35 ℃,检测波长280 nm;梯度洗脱的流动相A为0.2%磷酸溶液,流动相B为甲醇。洗脱程序:0～25 min,20%～35% B;25～40 min,35%～50% B;40～50 min,50%～90% B;50～60 min,90%～90% B。检测完毕后与混合标准品进行对比。

1.2.3 体外抗氧化活性测定

其中:V1:未加清除剂时的反应速率;V2:加入清除剂时的反应速率。

1.2.3.2 DPPH·清除作用的测定 参照文献[18-19]方法进行测定。分别配制质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的TFTB和芦丁溶液及VC(0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL)溶液作为清除剂。分别吸取2 mL浓度为0.2 mg/mL的DPPH 50%乙醇溶液及不同浓度清除剂置于具塞试管中,摇匀,避光反应30 min后,以无水乙醇作为参比于517 nm测定其吸光度Ai;方法同Ai操作,测定2 mL DPPH 50%乙醇溶液与无水乙醇混合反应后吸光度Ac;方法同Ai操作,测定2 mL不同浓度清除剂及50%乙醇溶液混合后吸光度Aj。按照公式计算清除率。用清除率表示清除剂的清除能力,清除率越大表示TFTB的抗氧化性越强。按以下公式计算:

其中:Ai:加清除剂时DPPH·体系的吸光度;Aj:清除剂的吸光度值;Ac:未加清除剂时DPPH·体系吸光度值。

其中:Ac:未加清除剂时吸光度值;Ai:加入清除剂时吸光度值;Aj:未加NaNO2时吸光度值。

1.2.4 解酒护肝作用评价

1.2.4.1 小鼠醉酒模型的建立 通过参考文献[21]制备小鼠醉酒模型,分别以0.15、0.20、0.23、0.25 mL/10 g剂量给各组小鼠一次性经口灌胃38%vol浓香型白酒,每组10只,确定能使小鼠出现翻正反射消失数量最大而不出现死亡的剂量为最佳致醉剂量。实验结果显示,在能够保证全部小鼠醒来的情况下,使小鼠醉酒只数达到最大的最佳致醉剂量为0.20 mL/10 g。

1.2.4.2 动物分组及给药 取50只雄性KM小鼠,按体重随机分为5组,每组10只。分别是醉酒模型组(0.5%的CMC-Na溶液)、阳性对照组(联苯双酯,150 mg/kg·bw)、TFTB低、中、高剂量组(100、200、300 mg/kg·bw)。在实验前先对小鼠禁食不禁水12 h,使用0.5%的CMC-Na溶解阳性药物及TFTB,各组小鼠以0.1 mL/10 g剂量分别灌胃对应剂量的溶媒、阳性药物及TFTB。各组小鼠在一次性灌胃溶媒或相应药物后30 min按照0.20 mL/10 g剂量一次性灌胃38%vol白酒。

1.2.4.3 小鼠醉酒情况观察 参考文献[22]中方法及标准对小鼠醉酒情况进行判定,实验各组小鼠灌胃白酒后,观察小鼠的醉酒现象。观察并记录小鼠醉酒耐受时间(从灌胃白酒后到醉酒的时间)、醉睡时间(翻正反射消失持续时间),并计算小鼠的醉酒率。以翻正反射消失作为判断小鼠醉酒的标准,即当小鼠保持背向下的姿势30 s以上时,则认为其翻正反射消失,判定为醉酒。

1.2.4.4 血清指标测定 实验各组小鼠分别于灌胃白酒后5 h,用1%戊巴比妥钠腹腔注射(40 mg/kg)麻醉,摘眼球取血,置EP管中,在4 ℃静置30 min后,3500 r/min离心10 min,取上层血清置另一EP管中,照谷草转氨酶(AST/GOT)试剂盒说明书中方法测定小鼠血清中AST活性。

1.2.4.5 肝脏指标测定 各组实验小鼠分别于灌胃白酒5 h后处死,取出肝脏,使用预冷的生理盐水反复冲洗,用滤纸吸干水分后,使用天平称重。称重后的肝脏加入预冷的生理盐水匀浆制备10%的肝组织匀浆液,组织匀浆液离心10 min(3000 r/min,4 ℃),取上清液分别按照相关试剂盒说明书操作,进行SOD、MDA和蛋白含量的测定。

1.3 数据处理

实验数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较组间差异,以P<0.05作为差异具有统计学意义的判断标准。方差齐时,采用LSD法进行两两比较,若方差不齐,则采用Tamhane’s法进行两两比较。醉酒率比较使用卡方检验,以上数据由SPSS 19.0 for Windows 进行统计分析处理。

2 结果与分析

2.1 TFTB样品组分的初步分析

从图1A可以看出,在此色谱条件下,8种黄酮类化合物的标准品得到较好分离,TFTB样品溶液色谱图中4个目标峰的保留时间分别与标准品溶液芦丁、山奈酚-3-O芸香糖苷、槲皮素、山奈酚的色谱峰保留时间一致,其中以芦丁相对含量最高,可达总黄酮含量的87.8%(图1B)。

图1 黄酮标准品(A)与TFTB(B)HPLC图

2.2 体外抗氧化活性

图2 不同添加量不同清除剂对超氧阴离子自由基的清除作用

2.2.2 对DPPH·清除效果 由图3可知,TFTB对DPPH·具有一定的清除能力,在试验浓度范围内,TFTB对DPPH·的清除能力随着浓度的增大而增加,呈现出量效关系。TFTB对DPPH·清除的IC50为0.02 mg/mL,即质量浓度为0.02 mg/mL时,体系中50%的DPPH·可被清除,但TFTB清除能力弱于同质量浓度的芦丁。在质量浓度为2.0 mg/mL时,TFTB对DPPH·的清除率能够达到90%,与芦丁的清除作用相当,但清除能力低于VC。郭刚军等[23]研究表明,苦荞黄酮对DPPH·具有较好的清除能力,清除DPPH·能力随着苦荞黄酮质量浓度的增大而升高,与本研究结果一致。

图3 不同添加量不同清除剂对DPPH·的清除作用

图4 不同添加量不同清除剂对的清除作用

注:与醉酒模型组相比,*表示具有显著差异,P<0.05;**表示具有极显著差异性,P<0.01。表2、表3同。

2.3 解酒护肝作用

2.3.1 防醉解酒作用 当按照实验确定剂量灌胃白酒后,各组小鼠均表现出不同程度的醉酒现象。具体表现为出现醉酒后的兴奋状态,爬行不稳,频繁用前肢搔头、闭眼不动等行为。由表1可知,在醉酒率方面,醉酒模型组有9只小鼠醉酒,醉酒率为90%,结合醉酒模型建立实验结果及文献报道,表明醉酒模型造模成功[22];TFTB各组醉酒率较之醉酒模型组略有降低但无显著性差异(P>0.05)。在耐受时间方面,与醉酒模型组相比,除TFTB高剂量组外,其他组耐受时间均有不同程度的缩短,一方面可能是酒精的摄入抑制了TFTB在体内的进一步吸收和利用,另一方面可能是TFTB对耐受时间的延长作用存在剂量依赖性。在醉睡时间方面,与醉酒模型组对比,TFTB组及联苯双酯组的醉睡时间均极显著缩短(P<0.01)。

表1 TFTB对小鼠耐受时间及醉酒时间的影响

2.3.2 TFTB对血清指标的影响 由表2可知,与醉酒模型组对比,TFTB组与联苯双酯组的AST水平均显著降低(P<0.05)。其中TFTB低剂量组降低转氨酶的效果与目前公认的降酶保肝药物联苯双酯的作用相当,与醉酒模型组对比具有极显著性差异(P<0.01)。

表2 TFTB对小鼠AST的影响

2.3.3 TFTB对肝脏指标的影响 由表3知,与醉酒模型组相比,TFTB组和联苯双酯组肝脏中SOD活性均极显著提升(P<0.01),但不同剂量组TFTB间无显著的量效关系。在肝组织MDA指标方面,与醉酒模型组对比,TFTB各组肝脏中MDA的含量均显著降低(P<0.05)。

表 3 TFTB对小鼠SOD、MDA的影响

3 讨论与结论

醉酒主要是指因大量饮酒而造成急性酒精中毒,使得机体中枢神经呈现出一种兴奋或抑制状态[28]。目前开发出的解酒产品主要是通过抑制胃肠等消化系统对酒精的吸收或直接作用于肝代谢酶系而加速酒精在体内的代谢而起到解酒效果[29]。朱振元等[30]研究葛根素的防醉解酒效果,结果显示,葛根素能够降低小鼠血清中的酒精浓度从而延长小鼠的醉酒耐受时间,缩短醉睡时间,具有良好的防醉解酒药效。本实验的研究结果表明,同醉酒模型组对比,给药300 mg/kg·bw TFTB能够延长醉酒耐受时间(P<0.05),同时TFTB各组小鼠醉睡时间均显著缩短(P<0.01)。结果表明,TFTB具有较好的防醉解酒作用。

AST主要存在于肝脏细胞的线粒体中,而酒精在肝脏代谢时产生的大量ROS将会损伤肝细胞线粒体膜及细胞膜,使得肝脏细胞中的AST大量释放至血液中引起指标的升高,因此血清中AST指标的含量是判断肝损伤的重要指标[31]。与醉酒模型组相比,TFTB各组及联苯双酯组血清中AST含量均显著降低(P<0.05),表明TFTB对小鼠酒精所致肝脏损伤具有一定的保护作用。Sun等[32]通过研究表明一种膳食类黄酮醇非瑟酮可以抑制酒精造成的氧化应激、肝细胞凋亡,脂质蓄积进而实现对肝脏的保护作用,因此TFTB对肝脏的保护作用可能与其体内抗氧化活性有关。

SOD在机体中的主要功能是清除体内的自由基,其在一定程度上反映了氧化应激反应的程度。酒精的刺激会造成肝脏中的SOD活性水平下降,导致机体内的氧化还原平衡的破坏[33]。MDA作为脂质过氧化终产物,可使核酸、蛋白质等大分子出现交联或断裂而影响细胞的正常生理活性,因此,MDA水平是脂质过氧化损伤的标志性产物,反映了活性氧对肝脏的损伤程度;酒精的摄入导致机体内的脂质过氧化反应增加,从而会引起肝脏中MDA含量的升高[33-34]。肝组织指标测定结果显示,与醉酒模型组对比,TFTB各组小鼠肝脏中SOD活力均极显著提升(P<0.01),且肝脏中MDA的含量均显著降低(P<0.05)。相关研究结果显示,黄酮类化合物可通过抑制氧化应激,改善脂质代谢,减轻线粒体损伤,诱导细胞凋亡等方式改善肝脏损伤[35]。也有研究表明芦丁可以减轻t-BHP诱导的小鼠肝脏的氧化应激损伤,有助于由氧化应激引起的相关疾病的预防和治疗[36]。而芦丁作为TFTB中主要的黄酮化合物,其作为一种膳食因子可能有助于改善机体细胞内氧化还原平衡。这提示TFTB对酒精造成肝损伤的保护作用可能是通过提高小鼠体内SOD酶活力加速细胞对自由基的清除并抑制细胞内脂质过氧化反应进而改善了氧化应激反应实现。