基于网络药理学探讨牛膝治疗膝骨性关节炎的有效物质与作用机制研究

潘 莉 郭 斌 唐徐韵 尚雪梅 胡蔚婧 杨孝芳

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002

膝骨性关节炎(Knee osteoarthritis, KOA)是以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的一种慢性关节病[1]，临床表现主要以膝关节疼痛、肿胀、畸形和功能障碍为主，不仅损害关节软骨，还累及整个关节，是中老年人的常见病、多发病[2-3]。该病发病率高，患病人数逐年增多，西药起效快，但具有明显的胃肠道副反应，不适宜长期应用，只可短期对症治疗[4]。近些年中医药在治疗骨关节疾病和自身免疫性疾病中展现出了良好的疗效[5-6]，因此中药候选药物备受期待和瞩目。

牛膝是临床治疗骨关节类疾病常用中药，属于苋科植物牛膝Achyranthes bidentate BI的根，具有补肝肾、强筋骨、活血通络等功效[7]。药理学研究表明[8-11]，牛膝具有抗炎、抗骨质疏松、免疫调节、软骨修复等多方面作用，但其治疗KOA的主要物质基础与作用机制尚不清楚。本研究旨在通过网络药理学和生物信息学方法，从分子水平上阐明牛膝治疗KOA的有效成分、作用靶点和关键机制通路，为后期的基础研究、新药开发和临床研究提供一定的参考和依据。

1 材料与方法

1.1 牛膝所含化合物的检索与筛选 通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)在“Herb name”选项中输入牛膝，对牛膝所有化合物进行检索，根据药物动力学和成药原则，设定口服生物利用度(Oral bioavailability, OB)≥30%和类药性指数(Drug-like index, DL)≥0.18为筛选条件进行筛选。

1.2 牛膝所含化合物作用靶点预测 通过TCMSP数据库中的Related Targets收集牛膝所含化合物作用的靶点并进行整理，通过Perl软件筛选有效化合物靶点基因，将所得的基因用Uniprot数据库进行筛选和映射得到对应的标准基因名。

1.3 KOA疾病靶点及牛膝作用于KOA的靶点预测 通过GeneCards、OMIM数据库以“knee osteoarthritis”为关键词进行检索，收集 KOA疾病相关靶点，为增强疾病与靶点的相关性，将GeneCards数据库检索出的靶基因按Relevance score≥10进行整理，并与OMIM数据库所得的靶基因进行合并、去重。将牛膝所对应的有效化合物预测的靶点与KOA疾病靶点导入VENNY 2.1 软件，获取牛膝作用于KOA的交集靶点。

1.4 构建药物-成分-靶点-疾病相互作用网络 将预测得到的牛膝有效成分和 KOA效应靶点等信息导入Cytoscape 3.7.1软件进行药物-成分-靶点-疾病调控网络关系图绘制，应用Cytoscape-Tool-Network Analyzer分析网络节点度和介数中心度，寻找牛膝治疗KOA关键化合物和靶点。

1.5 牛膝对KOA作用靶点的PPI网络构建 将获得的牛膝作用于KOA的靶点上传至在线 STRING 11.0数据库，选择物种为“Homo sapiens”(人类)，设置靶点间最低要求互动得分为0.9并隐藏网络中断开连接的节点，获取相应的蛋白相互作用图，并根据结果对靶点蛋白进行分析。

1.6 牛膝治疗KOA的GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析 应用DAVID 6.8数据库对潜在效应靶点蛋白进行基因本体论(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析选择生物过程(biological process)、细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)3个部分前10条进行绘图，KEGG筛选前20个条目进行气泡图绘制。

2 结果

2.1 牛膝所含化合物筛选结果 经TCMSP共检索到牛膝含有化合物176个，根据OB≥30%，DL≥0.18筛选后，得到有效活性成分20个。见表1。

表1 牛膝有效活性成分

续表1表1 牛膝有效活性成分

2.2 牛膝有效化合物作用靶点预测结果 将筛选出的20个牛膝有效化合物靶点进行整理，通过perl软件筛选有效化合物靶点基因，将所得的基因用Uniprot数据库进行筛选和映射得到363个对应的标准基因名。

2.3 KOA疾病靶点及牛膝作用于KOA的靶点预测结果 通过GeneCards检索收集 KOA疾病相关的靶点1878个，筛选Relevance score≥10分的靶点，筛选后剩余靶点201个；OMIM数据库所得靶点28个，汇总后去除重复共得到KOA相关疾病靶基因223个。将牛膝经过Uniprot数据库进行筛选和映射得到363个靶点与KOA收集到的223个疾病靶基因导入VENNY 2.1 软件，共得到29个共同靶点(见图1、表2)。

2.4 药物-成分-靶点-疾病相互作用网络结果 应用Cytoscape 3.7.1软件将预测得到的牛膝有效成分、作用靶点和KOA疾病靶点进行药物-成分-靶点-疾病调控网络关系图绘制(如图2所示)，并用Network Analyzer分析网络节点度和介数中心度，得出化合物槲皮素(quercetin，网络节点度=28，介数中心度=0.3187)，汉黄芩素(wogonin，网络节点度=12，介数中心度=0.0591)，山奈酚(kaempferol，网络节点度=10，介数中心度=0.0377)，黄芩素(baicalein，网络节点度=5，介数中心度=0.0098)为牛膝治疗KOA主要化合物；靶点前列腺素G/H合成酶2(PTGS2，网络节点度=12，介数中心度=0.1056)，前列腺素G/H合成酶1(PTGS1，网络节点度=11，介数中心度=0.0883)，一氧化氮合酶2(NOS2，网络节点度=7，介数中心度=0.0297)，雌激素受体1(ESR1，网络节点度=7，介数中心度=0.0308)，为主要相互作用靶点。

图1 牛膝作用于KOA的靶点预测图

表2 牛膝作用于KOA的靶点

2.5 牛膝对KOA作用靶点的PPI网络构建结果 将获得牛膝作用于KOA的29个靶点基因上传至在线STRING 11.0数据库，选择物种为“Homo sapiens”(人类)，设置靶点间最低要求互动得分为0.9并隐藏网络中断开连接的节点，获取相应的蛋白相互作用图如图3所示，根据Count值筛选列举牛膝治疗KOA排名前20的关键靶点结果如图4所示。

图2 药物-成分-靶点-疾病相互作用网络结果 注：六边形为中药牛膝；四边形为疾病KOA；三角形为牛膝治疗KOA主要化合物；椭圆形为主要作用靶点。

图3 牛膝对KOA作用靶点的PPI网络

图4 牛膝治疗KOA排名前20的关键靶点

2.6 牛膝治疗KOA的GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析结果 应用DAVID 6.8数据库对潜在效应靶点蛋白进行基因本体论(Gene Ontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析得出生物过程条目有1080条，细胞组成条目有8条，分子功能条目有36条，取每个部分排名前10的条目进行绘图、分析，不足10条的按实际富集信息展示，结果如图5所示。在生物过程分析中排名靠前的主要有细胞外基质、细胞外结构、神经炎症反应、对脂多糖的反应、急性期反应等；在细胞组成分析中排名靠前的主要有内质网腔、含胶原的细胞外基质、纤维状胶原三聚体、带状胶原纤维、胶原三聚体复合物等；在分子功能分析中排名靠前的主要有细胞因子活性、细胞因子受体结合、受体配体活性、整联蛋白结合、生长因子受体结合等。KEGG通路富集分析取前20条通路制作气泡图如图6所示。结果显示，晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGEs-RAGE)、白介素17(IL-17)、肿瘤坏死因子(TNF)、松弛素(Relaxin)、C-型凝集素(C-type Lectins) 、Toll样受体(TLR)等信号通路是牛膝治疗KOA主要靶点富集的通路。

图5 牛膝治疗KOA关键靶点GO富集分析

图6 牛膝治疗KOA关键靶点KEGG通路富集分析

3 讨论

膝骨性关节炎属于中医“痹症”范畴，痹症主要是由素体不足，正气偏虚，劳逸过度，腠理不密，卫外不固，外邪入侵，饮食失调等所造成，其反复发作可使津血运行不畅，气滞血瘀，久则损伤肝肾，造成肝肾亏虚，由此波及其他脏腑。所以活血化瘀和补益肝肾在痹症的治疗中显得尤为重要，而牛膝的主要功效为补肝肾，强筋骨，逐瘀通经。牛膝在很多名方、验方和名老中医治疗骨关节疾病中都有体现[12]，虽然取得了很好的疗效，但其具体分子机制方面的研究相对较少。

本研究发现，槲皮素(quercetin)，山奈酚(kaempferol)，黄芩素(baicalein)为牛膝治疗KOA主要化合物。Bing Wei等[13]研究发现，槲皮素可以通过减弱氧化应激反应和抑制软骨细胞外基质的降解来改善骨关节的变性。山奈酚可以促进MC3T3-E1细胞中miR-101的上调和Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而影响成骨细胞的增殖、迁移和分化[14]。黄芩素在体外和体内均能够显著降低与软骨炎症反应发生密切相关的基质金属蛋白酶(MMPs)的表达。此外，黄芩素还能减轻前交叉韧带横断诱发的家兔KOA模型的软骨损伤[15]。研究表明，KOA中局部炎症因子的释放与疼痛、肿胀和软骨分解相关[16]。此外，KOA还会产生大量的活性氧自由基，而大量的氧自由基又会导致长期炎症的病理发生和发展[17]。从牛膝中的主要有效成分槲皮素、山奈酚、黄芩素的药理作用可以看出其在抗炎、抗氧化、减轻骨损伤等发面发挥着良好的作用[18-20]，故牛膝可被认为是治疗KOA的有效候选药物。

从牛膝对KOA作用靶点的PPI网络及核心蛋白筛选的结果中发现，IL-6、IL-1β、JUN、CXCL8、CCL2、IL-10是牛膝作用于KOA的关键靶点。有研究显示[21-23]，IL-1β和IL-6是在关节软骨破坏和浸润过程中起主要作用的炎性细胞因子。趋化因子是骨关节疾病中关节组织代谢被破坏的介质[24]，CCL2的升高可以反映骨/软骨代谢的改变，导致关节破坏、介导KOA疼痛产生[25-27]。从PPI网络及核心蛋白筛选结果中可以看出，牛膝治疗KOA主要作用于与炎症、细胞周期、细胞增殖和凋亡等相关的靶点。

GO富集分析结果表明，在生物过程和分子功能中，细胞外基质和细胞因子活性具有显著意义。人类关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质构成，提高软骨细胞的数量和促进细胞外基质的分泌成为治疗骨性关节炎的一个重要突破点[28]细胞因子、趋化因子和共刺激分子等均能与成骨细胞和破骨细胞相互作用，共同调节骨形成和骨吸收，进而改变骨重塑的方向[29]。KEGG信号通路富集结果显示，牛膝治疗KOA主要涉及晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGEs-RAGE)、白介素17(IL-17)、肿瘤坏死因子(TNF)等信号通路。AGEs-RAGE信号通路富集最显著，关节软骨对AGE的积累特别敏感[30-31]，AGE的增加会减少关节软骨细胞中蛋白聚糖和胶原蛋白的合成。AGE的生物学活性被认为是由AGE的特异性受体(RAGE)介导的，RAGE的激活参与了与促炎反应相关的关键信号通路，从而激活各种炎症基因[32]。IL-17可以引起组织损伤和诱发自身免疫作用[33]。此外，IL-17还可以刺激许多趋化因子，引起滑膜中嗜中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的聚集，从而产生级联放大作用，导致更严重的关节损伤[34]。通过GO和 KEGG 富集分析结果表明，牛膝治疗KOA涉及多方面生物学过程和多条重要信号通路参与，也明确了牛膝治疗KOA的作用机制和有效性。

本研究表明，牛膝可以通过多成分、多靶点、多通路机制协同治疗KOA，为中药牛膝治疗KOA提供了重要的分子生物学科学依据，也为下一步实验研究奠定基础和方向。