下调miR-196b靶向核凋亡诱导因子1调控肝癌细胞生长和凋亡的机制

肖二辉, 宁会彬， 康月花， 殷 辉， 马 力, 毛重山， 赵 岩， 尚 佳

1 河南省人民医院 感染科， 郑州大学人民医院， 河南大学人民医院， 郑州 450003；2 阜外华中心血管病医院 急诊科， 河南省人民医院 心脏中心， 郑州 450003

肝癌是常见的恶性实体肿瘤，其恶性程度高、发展速度快，严重威胁着人类的生命健康[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种没有编码蛋白质功能的小分子RNA，其在人体组织中广泛表达，miRNA在肿瘤进展中发挥关键作用，miRNA异常表达与肿瘤细胞的恶性生长和凋亡有关，探讨miRNA在肿瘤中的作用对于靶向基因治疗肿瘤具有重要意义[2]。目前已知miR-196b在结直肠癌、白血病等肿瘤中异常高表达，在肿瘤进展中可能发挥促进作用[3-4]。既往研究[5]显示，miR-196b在肝癌中表达上调，而对于miR-196b在肝癌细胞增殖凋亡中的作用还不清楚。本次实验探讨下调miR-196b对肝癌细胞增殖、克隆和凋亡的影响和靶向调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料 肝癌细胞HuH-7、SNU-449、HepG2和人正常肝细胞HL7702均购自美国ATCC；肝癌细胞SMCC7721购自中国科学院上海细胞库；miRNA cDNA合成试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；inhibitor control、miR-196b inhibitor、miR-196b mimics、mimics control由上海吉玛制药技术有限公司合成；野生型(wild type，WT)和突变型(mutant，MUT)荧光素酶报告载体由南京科佰生物科技有限公司构建；核凋亡诱导因子1(nuclear apoptosis-inducing factor 1，NAIF1) siRNA、siRNA control由上海锐赛生物技术有限公司合成；Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗体、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，C-caspase-3)抗体购自碧云天生物技术研究所；NAIF1抗体购自美国Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR检测miR-196b在肝癌细胞中的表达变化 收集肝癌细胞HuH-7、SNU-449、HepG2、SMCC7721和人正常肝细胞HL7702，添加Trizol试剂，提取细胞中的总RNA，紫外分光光度法测定浓度及纯度。反转录体系为： primer mi×0.5 μl、RT primer 0.5 μl、5×RT Buffer 2 μl、RTase 0.5 μl、RNA 2.5 μl，添加二乙基焦磷酰胺水至10 μl，反转录条件为：16 ℃孵育30 min，42 ℃孵育90 min，72 ℃孵育5 min。Real-time PCR体系如下:2×Real-time PCR Master Mix 5 μl、上下游引物各0.2 μl、cDNA 2.5 μl，然后添加ddH2O至10 μl。Real-time PCR反应条件为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。U6为内参，按照2-△△Ct法计算miR-196b表达变化。引物为：U6-F，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6-R，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-196b-F，5′-CGGCGGTAGGTAGTTTCCTGTT-3′，miR-196b-R，5′-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′。

1.2.2 细胞转染和分组 取肝癌细胞HepG2，分成3组，分别为Control、Anti-NC、Anti-miR-196b组，Anti-NC、Anti-miR-196b为转染inhibitor control、miR-196b inhibitor的细胞，Control为没有转染的细胞。细胞转染步骤同Lipofectamine 2000转染试剂。细胞转染后48 h，利用Real-time PCR方法测定miR-196b表达变化(步骤同1.2.1)。

1.2.3 噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)检测下调miR-196b对肝癌细胞增殖的影响

收集转染后的Control、Anti-NC、Anti-miR-196b组细胞，接种到96孔板，每个孔中加5000个细胞，培养48 h后，进行MTT检测。步骤如下：在每个孔内加入20 μl的MTT，继续培养4 h，把孔内的液体吸弃，添加150 μl的二甲基亚砜，摇床孵育震荡10 min，测定570 nm的吸光度值(A值)，用不含细胞孔的检测值进行调零。

1.2.4 平板克隆实验检测下调miR-196b对肝癌细胞克隆能力影响 收集转染以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-196b组细胞，接种到细胞培养皿，培养14 d，出现肉眼可见的细胞克隆团，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下计数克隆形成数目。

1.2.5 流式细胞仪检测下调miR-196b对肝癌细胞凋亡的影响 收集转染48 h后的Control、Anti-NC、Anti-miR-196b组细胞，添加PBS洗涤2次，将细胞悬浮于400 μl的结合缓冲液中，添加膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)、碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色液各5 μl，避光反应20 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 Western Blot检测下调miR-196b对肝癌细胞中NAIF1、Bax、C-caspase-3蛋白表达的影响 收集转染48 h后的Control、Anti-NC、Anti-miR-196b组细胞，提取细胞蛋白。按照BCA方法测定蛋白的浓度。70 V电压电泳至溴酚蓝染料进入分离胶和浓缩胶的边缘，然后把电压调整到120 V继续电泳。设置100 V的电压转膜2 h。PVDF膜放在5%牛血清白蛋白溶液中孵育封闭2 h，然后放在一抗稀释液中在4 ℃过夜，最后将PVDF膜放在二抗稀释液中孵育2 h。二抗以1∶4000稀释，NAIF1、Bax、C-caspase-3抗体稀释倍数分别为1∶1000、1∶800、1∶600。滴加ECL显色试剂，Image J分析条带灰度值，β-actin作为内参，分析蛋白表达变化。

1.2.7 靶基因预测和鉴定 利用生物信息学软件targetscan预测miR-196b的靶基因，发现miR-196b同NAIF1的3′-非翻译区(3′-untranslated regions,3′UTR)端有互补结合位点，构建含有3′UTR端结合位点的WT荧光素酶报告载体，同时构建突变以后不含3′UTR端结合位点的MUT荧光素酶报告载体，将WT、MUT分别同miR-196b mimics、mimics control转染到肝癌细胞HepG2中，48 h后，用荧光素酶活性检测试剂盒测定细胞荧光素酶活性变化。

1.2.8 NAIF1 siRNA对下调miR-196b调控肝癌细胞增殖、克隆、凋亡的影响 将miR-196b inhibitor、NAIF1 siRNA和miR-196b inhibitor、siRNA control分别共转染到肝癌细胞HepG2中，命名为Anti-miR-196b+si-NAIF1和Anti-miR-196b+si-NC，将NAIF1 siRNA和siRNA control分别转染到肝癌细胞HepG2中，记为si-NC和si-NAIF1，按照上述MTT、平板克隆、流式细胞仪、Western Blot方法测定细胞增殖、克隆、凋亡和NAIF1、Bax、C-caspase-3蛋白表达水平。

2 结果

2.1 miR-196b在肝癌细胞中表达上调 肝癌细胞HuH-7、SNU-449、HepG2、SMCC7721中miR-196b水平明显高于人正常肝细胞HL7702(P值均<0.05)(表1)，提示miR-196b在肝癌细胞中表达上调。

表1 肝癌细胞HuH-7、SNU-449、HepG2、SMCC7721和人正常肝细胞HL7702中miR-196b表达的比较

2.2 miR-196b inhibitor下调肝癌细胞中miR-196b表达水平 与Anti-NC组比较，Anti-miR-196b组肝癌细胞中miR-196b表达水平明显降低(P<0.05)(表2)，提示miR-196b inhibitor下调肝癌细胞中miR-196b表达水平。

表2 miR-196b inhibitor转染后肝癌细胞中miR-196b水平比较

2.3 下调miR-196b对肝癌细胞增殖、克隆和凋亡影响

与Anti-NC组比较，Anti-miR-196b组肝癌细胞A值、克隆形成数目均明显下降，细胞凋亡率和细胞中Bax、C-caspase-3蛋白表达水平均明显升高(P值均<0.05)(图1，表3)，提示下调miR-196b抑制肝癌细胞增殖、克隆并诱导细胞凋亡。

表3 miR-196b inhibitor转染后肝癌细胞A值、克隆形成数目、凋亡率和Bax、C-caspase-3蛋白相对表达量比较

2.4 miR-196b靶向负调控NAIF1表达 利用生物信息学软件预测发现miR-196b同NAIF1的3′UTR端有互补结合位点，荧光素酶报告系统鉴定结果显示NAIF1为miR-196b的靶基因；与Anti-NC组比较，Anti-miR-196b组肝癌细胞NAIF1蛋白表达水平升高(P<0.05)(图2，表4、5);提示miR-196b靶向负调控NAIF1表达。

表4 荧光素酶活性变化

表5 miR-196b inhibitor转染后肝癌细胞中NAIF1蛋白水平比较

2.5 NAIF1 siRNA逆转下调miR-196b对肝癌细胞增殖、克隆和凋亡影响 与Anti-miR-196b+si-NC组比较，Anti-miR-196b+si-NAIF1组肝癌细胞A值升高，克隆形成数目增加，细胞凋亡率降低，NAIF1、Bax、C-caspase-3蛋白水平也下降(P值均<0.05)；与si-NC组比较，si-NAIF1组肝癌细胞A值升高，克隆形成数目增加，细胞凋亡率降低，NAIF1、Bax、C-caspase-3蛋白水平也下降(P值均<0.05)(图3,表6)。

表6 NAIF1 siRNA和miR-196b inhibitor共转染后肝癌细胞A值、克隆形成数目、凋亡率和NAIF1、Bax、C-caspase-3蛋白相对表达量比较

3 讨论

miRNA不具备编码蛋白质的功能，参与多种生理过程，miRNA还与肿瘤的发生有关，在肿瘤进展中扮演促进作用或抑制作用[6-8]。miR-196b是一个多功能调节因子，在脂肪细胞分化、骨髓生成中具有调控作用[9-10]。近年来的研究[11]显示，miR-196b与肺癌等肿瘤有关，其在肿瘤中高表达。研究[5]表明，miR-196b在肝癌组织中高表达，其在肝癌进展中可能发挥促进作用。本次研究发现，miR-196b在肝癌细胞中的表达水平升高，下调miR-196b后的肝癌细胞的增殖和克隆能力下降，这可能提示，miR-196b在肝癌进展中发挥促进作用。

本实验发现下调miR-196b后的肝癌细胞凋亡水平增加，提示下调miR-196b具有诱导肝癌细胞发生凋亡的作用。细胞凋亡减少是肿瘤发生的基础，而细胞凋亡发生是一个复杂的基因调控过程，与细胞内的多种蛋白、因子表达改变有关[12]。Bcl-2和caspase蛋白家族是目前研究较多的与细胞凋亡相关的调控蛋白，在细胞凋亡过程中分别发挥促进和抑制作用[13-14]。Bax是Bcl-2蛋白家族成员，具有促进细胞凋亡进程的作用[15]。caspase-3是caspase蛋白家族的成员，只有其被剪切活化后才可以发挥促进凋亡的作用，并且caspase-3活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[16]。本次实验发现下调miR-196b可以促进肝癌细胞中Bax和C-caspase-3蛋白表达，进而诱导肝癌细胞发生凋亡，这与细胞凋亡检测结果一致。

miRNA发挥生物学功能与靶向影响下游基因的表达有关，其可以与靶基因的3′UTR端互补结合，从而抑制蛋白翻译，同一个miRNA可能同时具有多个靶基因，分别可能在不同的病理或生理过程中发挥作用[17-18]。miR-196b参与肿瘤进展与靶向调控基因的表达有关。本次的实验表明，miR-196b可以靶向负调控NAIF1表达。NAIF1是一个与细胞凋亡有关的基因，具有诱导细胞凋亡的作用[19]。NAIF1在胃癌、肝癌等肿瘤组织中异常低表达，而上调NAIF1表达可以抑制肝癌细胞的增殖能力[20-22]。本实验表明，下调NAIF1可以逆转下调miR-196b对肝癌细胞抑制增殖和促进凋亡的作用，这提示miR-196b通过靶向调控NAIF1表达参与肝癌细胞生长和凋亡。

总之，miR-196b在肝癌细胞中高表达，并且在肝癌的进展过程中发挥促进作用，而下调miR-196b通过靶向负调控NAIF1抑制肝癌细胞生长并诱导细胞凋亡，这提示靶向miR-196b可能是肝癌治疗的途径之一。以后将会探讨miR-196b在肝癌细胞裸鼠移植瘤生长中的作用和机制。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：肖二辉负责课题设计，资料分析，撰写论文；宁会彬、殷辉参与收集数据；康月花、赵岩负责实验操作；毛重山负责修改论文；马力负责拟定写作思路；尚佳指导撰写文章并最后定稿。