circRNA在肝细胞癌中的作用机制

郭 璇， 谭 为， 王昌俊

1 华南理工大学医学院， 广州 510006； 2 广东省人民医院，广东省医学科学院， 广东省老年医学研究所， 广州 510080

肝细胞癌(HCC,简称肝癌)是肝脏中最常见的恶性肿瘤,居全球癌症相关死亡的第三位,生存率极低[1]。因此,肝癌已成为世界范围内严重的公共健康卫生问题。HCV和HBV感染、毒素、吸烟、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝病等是进展为HCC的主要危险因素[2]。迄今为止,肝癌的临床治疗方法主要包括手术切除、放化疗、局部射频消融、肝移植、靶向治疗、免疫治疗等，早期肝癌常规上仍以手术为主要治疗手段[3]，但大多数晚期患者却缺乏有效的治疗方法，为了提高肝癌患者的生存率，迫切需要探索肝癌发生的分子机制，寻找有价值的肝癌诊断标志物和治疗靶点。

环状RNA(circRNA)是一类新的内源性非编码RNA，通过反向剪接，由原转录物的外显子或/和内显子序列产生。与具有5′到3′端的经典线性RNA不同，circRNA产生共价闭环结构，从而防止被RNA外切酶或RNase R降解，因此，circRNA比线性mRNA更稳定，这使得它们比来自相同基因的典型线性转录产物更丰富[4]。近年来的研究[5-6]表明circRNA与肝癌关系的发生发展有关，并在许多生物学过程中发挥了重要作用，可能成为潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。本文综述了近年来关于circRNA与肝癌关系的研究进展，并讨论了circRNA在肝癌治疗和诊断中的价值，为进一步深入研究circRNA在肝癌中的作用机制提供新的思路和方法。

1 circRNA的生物起源

circRNA最早存在于真核细胞的细胞质中,在1979年通过电子显微镜观察到,随后在高等植物中作为致病性感染RNA被发现[7]。circRNA的生物发生可分为3种类型：ciRNA(环状内含子RNA)、Ecircnas(环状外含子RNA)和EIciRNA(外显子-内含子环状RNA)[8]。其形成机制为：内含子配对驱动的循环是通过位于互补序列或反向重复序列两侧的内含子的直接碱基配对来实现的[9]。RNA相关结合蛋白(RBP)相关配对驱动中，其在转录过程中RBP嵌入到前体RNA中，与侧翼内含子序列结合，使前体RNA发生弯曲和折叠，形成交叉区域的环状[9]。在套索驱动的模型中，它发生在外显子跳跃事件或从前体mRNA中去除内含子的过程[10](图1)。

2 circRNA的生物学功能

circRNA是非编码RNA(ncRNA)研究领域的新分子，其生物学功能已被广泛研究。它们的功能可分为四个部分：作为microRNA(miRNA)海绵调节其功能，作为转录或翻译调节因子，与蛋白质相互作用调节基因表达，具有编码蛋白质的潜力(图2)。

2.1 circRNA作为miRNA海绵 circRNA被证明作为miRNA海绵，可将miRNA从其靶mRNA中分离出来,从而缓解miRNA介导的基因抑制或表达。最典型的例子是Cdr1as，哺乳动物大脑中有丰富的circRNA，它包含70多个保守的miR7结合位点和与整个成熟miR-671序列完全互补的miR-671位点，可直接调节miRNA及其协同基因的功能[11]。Circ-FOXM1通过作为竞争性内源性RNA促进癌症进展，表现出对miR-1304-5p的海绵作用，通过circ-FOXM1/miR-1304-5p上调促进了非小细胞癌系的增殖和侵袭性[12]。circHIPK3通过与包括肿瘤抑制因子miR-124在内的多个miRNAs结合，在癌细胞生长中表现出促进作用[13]。现有的结果显著地证明了circRNA-miRNA相互作用对生物体是至关重要的。

2.2 circRNA作为转录调节因子 尽管circRNA大多由外显子产生,分布于细胞质中，但ciRNA和EIciRNA在细胞核中大量存在，并作为转录调控顺式元件发挥作用[14]。一些ciRNA通过促进RNA聚合酶Ⅱ的延伸活性来调节其亲本基因的转录[10,14]。EIciRNA通过与RNA聚合酶Ⅱ及其编码基因U1小核核糖核蛋白的启动子相互作用，增强其亲本基因转录[15]。

因此，虽然ciRNA和EIciRNA不能作为miRNA海绵发挥作用，但它们可以通过其他途径调节基因表达和转录，这一点在研究中已得到证实。

2.3 circRNA具有翻译蛋白质的能力 一些circRNAs有开放阅读框和内部核糖体结合位点，表明其具有翻译蛋白质的潜力[16]。CircLINC-PINT可以编码肽链，抑制癌基因的转录，从而在胶质母细胞瘤中发挥抑癌作用[17]。Circ-FBXW7在人脑中被发现上调，并编码了一种被称为FBXW7-185aa的21 kDa蛋白，这种蛋白可以抑制癌细胞增殖和细胞周期循环[18]。另一项研究[19]表明，在存在翻译起始因子EIF4G2和YTHDF3的情况下，n6 -甲基腺苷的修饰足以促进人类细胞中circRNA蛋白翻译的起始化。

2.4 circRNA与蛋白质之间的相互作用 circRNA可能具有通过结合、储存、排序和将蛋白质隔离到特定亚细胞位置来调节蛋白质功能的潜力，并充当调节蛋白质-蛋白质相互作用的动态支架分子[20]。最新研究[21]表明，8种RBPs与肝癌细胞的circRNA相互作用，SCD-circRNA 2可调控RNA结合基序蛋白3，在肝癌中起重要作用。另一方面，circRNAs可以通过与其相应的亲本mRNA竞争性结合RBP而影响翻译过程，circPABPN1与HuR的广泛结合阻止了HuR与PABPN1 mRNA的相互作用，从而抑制了PABPN1 mRNA的翻译[22]。所有的证据都表明，circRNA更有可能通过作为蛋白复合物的支架来调节蛋白的功能，而不是简单的与单个蛋白结合。

3 circRNA在HCC中的作用

越来越多的证据表明，大量的circRNA在HCC组织中异常表达，提示这些circRNA可能在HCC的癌变和发展过程中发挥重要作用，一些circRNA在HCC中的作用见表1。

3.1 circRNA参与HCC的迁移和侵袭 有证据表明circRNA SMAD2在HCC组织中表达降低[23]，其过表达可抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，miR-629被证实是circSMAD2的靶点，miR-629可以逆转circSMAD2在HCC进展中的影响。此外，发现EMT诱导的转录因子Twist1可以上调Cul2 circRNA (circ-10720)的表达[24]，circ-10720与肝癌的进展及不良预后呈正相关，进一步研究发现，circ-10720在HCC中促进癌细胞的迁移和侵袭。因此，Twist/circ-10720通路对HCC的EMT进展具有促进作用。还有研究[25]发现，circβ-catenin在肝癌组织中高度表达，沉默circβ-catenin显著抑制体内外的恶性表型，它通过内部核糖体结合位点启动翻译蛋白质，导致Wnt信号通路活化，促进癌细胞的迁移。

表1 一些表达失调的circRNAs在HCC中的作用和功能

3.2 circRNA与HCC转移相关 有研究发现，circ-ADD3在HCC中显著下调，其高表达与血管浸润、肝内转移以及远处转移呈负相关。circ-ADD3通过调节EZH2稳定性降低启动子区域上的H3K27me3水平，从而形成调节电路，抑制HCC转移[26]。circ-ZNF652(hsa_circ_0003258)在HCC组织和细胞系中显著上调，circ-ZNF652可以与miR-203和miR-502-5p相互作用，以增加其共同靶基因Snail(触发EMT的关键转录因子)的表达，从而促进HCC的转移[27]。

3.3 circRNA与HCC细胞增殖相关 已经发现hsa_circ_0005986在HCC组织中表达降低[28]，hsa_circ_0005986通过与miR-129-5p结合，降低了靶基因Notch1的表达水平。此外，其下调通过细胞周期的转变而促进HCC细胞的增殖。另外，circMTO1通过吸收miR-9来稳定p21 mRNA，导致p21蛋白水平升高。因此，在HCC中，circMTO1的下调会加速细胞周期的进展[29]。circSETD3抑制了HCC细胞的增殖并诱导了G1/S周期阻滞。此外，circSETD3充当miR-421的海绵，并证实有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)14是miR-421的新型靶标，通过circSETD3/miR-421/MAPK14途径抑制HCC的生长[30]。

3.4 circRNA与HCC血管生成有关 circRNA-100338在HCC细胞及其分泌的外泌体中均高表达，试验[31]表明，外泌体来源的circRNA-100338促进人脐静脉内皮细胞的增殖、血管生成和血管生成模拟物的形成能力。Hsa-circ-0046600在肝癌组织中高表达，且与肿瘤的大小、TNM分期和病理性血管侵犯有关，通过竞争性结合miR-640来促进HIF-1α等蛋白的表达，从而影响肝癌细胞的恶性血管生成[32]。

3.5 circRNA与HCC耐药相关 在HCC组织(包括顺铂敏感组和顺铂耐药组)中，circRNA-101505的表达较邻近组织降低，并且与不良的生存结果相关，研究人员进一步确定了circRNA-101505在肝癌中的抑癌作用，即circRNA-101505的过度表达通过促进miR-103增加含氧化硝基结构域蛋白1的表达而抑制细胞增殖并增强顺铂的毒性[33]。作者发现circRNA circFBXO11在HCC组织中显著上调，且circFBXO11过表达与预后不良有关。circFBXO11可促进HCC增殖、周期进展和奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)耐药。研究[34]揭示了circFBXO11/miR-605/FOXO3/ABCB1轴在HCC OXA耐药中的作用。circ_0003418在肝癌组织和细胞株中低表达，且与肿瘤的大小、TNM分期和HBsAg水平相关。circ-0003418通过抑制Wnt/β-catenin途径在肝癌中发挥抗肿瘤作用，抑制HCC细胞的增殖，迁移和侵袭，并提高肝癌细胞对顺铂的敏感性[35]。

4 circRNA在HCC诊治中的临床意义

由于大多数晚期HCC患者确诊时，错失了最佳的治疗时期，因此，肝癌的早期诊断显得尤为重要。传统上，通过血清检测，甲胎蛋白被广泛作为诊断HCC的分子标志物。美国肝病学会的2010年指南正式规定不再推荐甲胎蛋白筛查，因此，为了提高HCC患者的治疗效果和预后，有必要寻找更高效的生物标志物以提高HCC的早期诊出率。circRNA在细胞质中具有进化保守、数量丰富、结构稳定的特点，在肿瘤诊断中具有巨大的潜力[4]。circRNA在HCC诊断中的潜在价值已被揭示，与癌旁非癌组织相比，hsa_circ_0001649、hsa_circ_0003570在HCC标本中表达明显下调，具有与肝硬化、慢性肝炎相鉴别的能力，其诊断性能受试者工作特征曲线下面积分别为0.631、0.868，具有良好的肝癌诊断能力[5-6]。hsa_circ_0128298和hsa_circ_0027089在HCC样本中较癌旁非癌组织表达上调，并参与了HCC的发生发展，是可靠的诊断标志物(受试者工作特征曲线下面积: 0.668 vs 0.784)[36-37]。目前，对于肿瘤的检测指标依然以组织活检为金标准，如果circRNA的诊断能力能够有效应用于临床，那么基于circRNA的血液或尿液检查能够使肿瘤患者免遭侵入性探查的痛苦，有助于进一步提高肝癌的精准诊断和个体化治疗水平，随着越来越多的机制被探明，利用circRNA的诊断和治疗有望应用于临床。

5 结论

越来越多的证据表明，circRNA的表达改变会影响肝癌的发生发展，这些circRNA在肝癌的诊断、治疗和预后方面有巨大潜力。circRNA丰度高、稳定性好，还存在于不同的细胞外液中，包括唾液、血液和尿液[38]，是理想的HCC诊断标志物和治疗靶点。然而，与miRNA、lncRNA等其他ncRNA相比，circRNA在HCC中的研究仍不完善。到目前为止，RNA- seq已经在不同组织和疾病中识别出数千种推测的circRNA，但其中绝大多数尚未被其他技术验证或进行功能研究，在HCC中只鉴定了少量的功能性circRNA。这些circRNA通常通过miRNA海绵功能来调控HCC进展，参与细胞周期、增殖、侵袭和转移的基因/蛋白的表达。因此，circRNA的特征，包括它们的生物发生、降解和功能仍有待阐明。目前，有证据显示开发纳米载体来传递siRNAs或miRNAs，携带化疗药物，通过靶向不同的治疗机制产生协同效应[39]。因此，共传递纳米系统可以推广到circRNA谱，利用质粒增加真核circRNA的表达，利用CRISPR/Cas9或siRNA技术降低circRNA的表达[40]，从而提高临床疗效，改善整体的治疗效果。然而，circRNA结构的特殊性和技术的不足限制了对circRNA功能的探讨。因此，开发和使用合适的技术来阐明circRNA在HCC中的分子机制及其调控网络是重要的。笔者团队下一步的研究是circRNA如何协调肝癌调控网络，以及其如何在未来的治疗策略中发挥作用。

作者贡献声明：郭璇负责课题设计，资料分析，收集数据，撰写论文；谭为、王昌俊负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。