利用分子标记辅助选育抗稻瘟病粳稻新品系

何弯弯,王健康,丁成伟,胡婷婷,郭荣良,吴玉玲,徐家安,王友霜,赵轶鹏

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏 徐州 221121)

0 引言

水稻是世界上主要的粮食作物之一。由Magnaportheoryzea引起的稻瘟病对水稻生产造成了严重的灾难[1]。全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失达10%～30%,直接经济损失超过了70亿美元,损失的粮食足以养活6000万人口[2]。因此,稻瘟病已成为主要影响水稻产量稳定和粮食安全的重要因素之一。在目前的水稻品种审定条例中,稻瘟病抗性是一项重要的评价性状,多数省份要求稻瘟病抗性综合指数达到中抗以上水平。长期实践证明,将多个具有广谱抗性的稻瘟病基因聚合到一个品种上,是培育持久抗病品种的有效措施之一,也是防控稻瘟病最为经济有效的措施。

随着分子生物学和生物技术的迅速发展,目前已经鉴定出110个抗稻瘟病基因[3-7],且至少有26个稻瘟病抗性基因已被克隆[3,8],这些已克隆的抗稻瘟病基因的相关分子标记相继被开发,并用于抗性基因聚合的研究或育种工作中。陈红旗等[9]将3个抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-2以及Pi-33通过分子标记辅助选择聚合于水稻保持系金23B中;Jiang等[10]将抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-2和D12导入水稻保持系Jin 23B中;Hittalmani等[11]通过分子标记辅助选择,将3个稻瘟病抗性基因Pi1、Piz-5及Pita聚合到感病品种CO39中;陈学伟等[12]将Pi-d(t)1、Pib、Pi-ta2聚合于G46B中;姚姝等[13]将Pi-ta、Pi-b和Wx-mq基因聚合,选育出新品系南粳0051。鉴定结果表明,这些育成的改良品系对稻瘟病的抗性、产量和食味品质均得到了显著提高。越来越多的抗稻瘟病基因的挖掘、定位和克隆为水稻抗稻瘟病育种提供了丰富的抗性资源,同时分子标记辅助选择技术的快速发展使得培育抗病水稻品种的周期缩短,效率提高。

Pib是第1个被成功克隆的稻瘟病抗性基因,该基因位于水稻的第2染色体长臂末端,编码产物包含1251个氨基酸,含1个核苷酸结合位点(nucleotide binding site, NBS)和富含亮氨酸重复区(leucine-rich reports, LRR),并受温度和黑暗条件的诱导表达[14]。该基因对日本大部分菌株具有高抗性[15],多年来在我国东北地区起到了主要抗病作用[16-17],也是目前研究最广泛的抗病基因。杨杰等[18]对我国115份粳稻地方水稻品种进行了检测,发现仅有两个材料携带Pib抗病基因,这说明抗病基因Pib在我国地方品种中分布较少。Fjellstrom等[19]针对稻瘟病抗、感等位基因功能基序的差异,采用等位基因特异PCR方法设计了特异扩增Pib基因及其等位基因的功能标记。本研究利用该标记,通过含抗稻瘟病基因Pib的津稻179材料对徐稻3号进行了稻瘟病抗性改良，并通过分子标记辅助选择技术,选育出农艺性状优良且稻瘟病抗性增强的4个品系。

1 材料和方法

1.1 供试材料及选育方法

供体亲本:抗稻瘟病材料津稻179,含有广谱抗稻瘟病的Pib基因。受体材料:徐稻3号,为江苏徐淮地区徐州农业科学研究所自主选育并大面积推广的国审品种,目前作为黄淮地区中熟中粳对照品种。近年来徐稻3号对稻瘟病的抗性减弱,急需改良。我们以徐稻3号为母本,以津稻179为父本,获得杂交一代F1,分子标记检测确认其携带Pib；再以徐稻3号为父本,与F1进行两次回交,每次都保留含有Pib抗性基因的株系；再进行自交,获得稳定的携带Pib的品系,最终筛选出农艺性状优良且稻瘟病抗性增强的4个品系。

1.2 稻瘟病人工接种鉴定与田间诱发鉴定及评价

1.2.1 苗瘟接种鉴定 供试菌株为2015-248A3、2016-218C、2015-335D7、139E和2015-80F1,由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。供试材料种子经浸泡催芽后,点播于塑料育秧盘(60 cm×30 cm×4 cm)中。每盘播8行,每行3穴,共24穴,每穴6～8株苗。每盘均播种苏御糯作为感病对照,3次重复。当水稻幼苗长至3～4叶期时进行喷雾接种,所用孢子液浓度为5×104个孢子/mL,每个秧盘内接种40～50 mL的孢子悬浮液[20]。在温度为26 ℃、相对湿度为95%的恒温保湿箱内黑暗保温保湿24 h，然后转移至遮荫苗床。苗床温度保持在25 ℃左右,并定时喷雾保湿(白天间隔2 h喷雾1次,每次1～2 min),促使秧苗发病。在接种7～10 d后,当感病材料苏御糯出现典型病斑时进行调查分析。按6级分类调查法,0～2级植株为抗病表型(R),3～5级植株为感病表型(S)[21]。

1.2.2 穗颈瘟人工接种鉴定 采用人工注射接种方法,接种稻瘟病菌的混合孢子液[22],具体操作如下:在水稻孕穗至破口期,使用注射接种的方法进行穗瘟病菌接种,所用孢子液浓度为5×104个孢子/mL,每个家系至少接种10个植株,每个植株接种3个稻穗。在水稻成熟后进行水稻穗颈瘟的抗性调查。参照江苏省农业科学院植物保护研究所稻瘟病鉴定标准,0级为无病,免疫;1级为1/4以下枝梗发病或穗颈有斑点,抗病;2级为1/4以上枝梗发病或主轴中部发病,或颈部有病,但对产量无明显影响,中抗;3级为主轴中部或颈部有病,对产量有显著影响,感病;4级为穗颈发病造成白穗,高感[23]。

1.2.3 病圃自然诱发鉴定 在连云港赣榆的自然发病圃进行诱发鉴定。该试验点光照少、田间湿度高,非常适于稻瘟病的发病。在田块四周种植稻瘟病高感品种苏御糯作为诱发品种。田间水、肥管理与一般大田相同,但在整个生育期内不防治病害。观察整个生育期内水稻稻瘟病的发生情况,在成熟期调查水稻穗颈瘟的发生情况。

1.3 分子标记辅助选择

在水稻3～4叶幼苗期取新鲜叶片,采用CTAB法提取基因组DNA。参考前人的报道,分别合成能够扩增Pib基因的引物序列(表3)。用于PCR扩增反应的引物由上海擎科生物工程有限公司合成。PCR反应体系为20 μL,包含1.0 μmol/L的正向和反向引物各0.5 μL、10 mmol/L的dNTPs 0.5 μL、10×PCR buffer 2 μL、100～200 ng的DNA模板1 μL、5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.2 μL和ddH2O 13.3 μL。不同基因聚合酶链式反应(PCR)扩增的程序,除了退火温度和延伸时间有差异外(表1),其他PCR反应参数均为: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性40 s,退火时间40 s,延伸温度72 ℃，共32个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳分离后,用Bio-RAD凝胶成像仪(意大利 Bio-RAD公司)拍照记录。

1.4 农艺性状的考察及统计

参与农艺性状考察的株系的播种期和试验地点与人工接种试验相同,每个株系栽插5行，每行10株，共50株,2次重复。常规肥、水管理,记载生育期、株高、分蘖数等主要农艺性状；在成熟后取10株按常规方法调查其产量构成性状。

2 结果与分析

2.1 亲本及育成株系的稻瘟病抗性

2.1.1 苗瘟抗性鉴定结果 在2018年9月,利用5个菌株对亲本材料、4个品系以及感病对照进行喷雾接菌鉴定,3次重复结果显示,感病对照苏御糯对5个菌株均感病,达到5级,说明发病程度较重，适合进行抗性鉴定(表1)。亲本材料及4个品系对5个菌株的抗感情况如表1所示,其中株系对2015-248A3的抗性来自徐稻3号,对2016-218C、2015-335D7和2015-80F1的抗性来自津稻179；徐稻3号和津稻179对139E均表现为感病。

表1 亲本和4个品系对苗瘟的抗性鉴定结果

2.1.2 穗颈瘟抗性鉴定结果 在2017年正季，将4个品系种成4行区，每行10株，共计40株，进行表型鉴定。稻瘟病的田间抗性鉴定以苏御糯为感病对照,以亲本津稻179为抗性对照。采用来自江苏不同地区的6个优势稻瘟病生理小种混合孢子液对不同的株系进行穗颈瘟接种鉴定;将亲本材料及4个品系在赣榆病圃中进行自然诱发鉴定,四周均种植苏御糯作为诱发材料。在黄熟初期,调查亲本及4个品系在人工接种和自然诱发条件下的发病情况。鉴定结果表明：苏御糯和津稻179在人工接种条件下对穗颈瘟的抗性分别为4级和1级,在自然诱发条件下的穗颈瘟抗性分别为4级和0级,说明试验区稻瘟病的发病较为充分,能够有效鉴定株系在田间的抗性水平；4个品系的发病率为1%～2%,其中X13的抗性水平与抗病亲本津稻179相当,表现为抗,而X40、X41和X42均表现为中抗；4个品系的抗性水平均超过了受体亲本徐稻3号(表2)。说明利用Pib分子标记进行稻瘟病抗性的辅助选择是行之有效的。

表2 亲本和4个品系对穗颈瘟的抗性鉴定结果

2.2 亲本及育成株系的抗稻瘟病基因的检测

在分蘖盛期,利用分子标记检测亲本材料及株系所含的抗稻瘟病基因Pib,Pib基因的扩增引物如表3所示；当扩增产物片段大小为365 bp时为抗性基因Pi-b；当扩增片段大小为803 bp时为感病等位基因pi-b。PCR结果如图1所示,4个品系及亲本津稻179都含有抗病基因Pi-b,而徐稻3号含有感病等位基因pi-b。

M: marker;1:徐稻3号;2:X13;3:X40;4:X41;5:X46;6:津稻179。图1 亲本及育成品系Pib基因的分子检测结果

表3 用于PCR反应的引物名称、序列及预期片段长度

2.3 亲本及育成品系的农艺性状考察结果

利用徐稻3号与津稻179进行杂交,获得F1；在F1中去除假杂种后与徐稻3号回交。获得的后代通过分子标记检测选择携带Pib基因的个体,连续自交5代后获得遗传稳定、株型偏向徐稻3号且携带Pib基因的4个品系。将4个品系及亲本材料种成小区,每个小区40株,随机选取10株进行农艺性状考察。从表4可以看出：4个品系在株高、每穗总粒数上与徐稻3号存在极显著差异；在千粒重上与徐稻3号存在显著差异。

表4 亲本及育成株系的农艺性状及产量性状

3 讨论

3.1 分子标记辅助选择在育种中的应用

近年来,我国各级品审和管理部门对水稻稻瘟病抗性低的品种(系)实行淘汰制,新审定的品种均要达到中抗以上水平[26]。随着稻瘟病暴发带来的产量和经济损失,抗稻瘟病品种的选育与种植是控制稻瘟病最经济、安全、有效的途径[24-25]。分子标记辅助选择技术可在水稻的整个生育期进行目标基因鉴定,从而显著提高了目标性状的选择效率。利用与抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记或功能标记选育抗病品种或品系具有周期短、成效快、目标性强等优点。本研究以改良徐稻3号的稻瘟病抗性为重点,以携带抗稻瘟病基因Pib的材料津稻179为供体亲本,结合分子标记辅助选择与人工接种稻瘟病菌株技术,尽可能地排除由稻瘟病菌小种的遗传复杂性及致病力的易变性引起的不确定性因素,确保抗病基因选择的准确性,将MAS技术与系谱选育方法相结合,通过抗病性鉴定和农艺性状选择,最终获得了抗稻瘟病的新品系。

3.2 抗稻瘟病基因Pib的应用

抗稻瘟病基因Pib是个主效基因,能成功应用于稻瘟病抗性品种的选育。本实验利用Pibdom和Lys145两个标记检测抗稻瘟病基因Pib和感病等位基因pib,能够直接确定纯合的抗病基因Pib材料。本实验将常规杂交育种技术与分子标记辅助选择相结合,在整个抗稻瘟病基因筛选育种过程中对每一代都进行严格筛选,且只挑选高抗稻瘟病的植株,通过田间抗性鉴定及人工接种鉴定来验证所选择标记的准确性,同时注重农艺性状的选择。通过结合MAS技术和人工接种稻瘟病的方法,可以将Pib基因转入到水稻品种中,从而产生抗性；然后聚合其他的抗病基因,产生持久抗性,可以最大程度地延长优良品种的使用年限。