Klotho对缺血再灌注急性肾损伤的影响研究

章炜 王鸣 费晓 葛玉英 杨秀 谢祥成 杨丽莉 钱盈盈

急性肾损伤是临床常见的危重病之一，具有发病率高，病情凶险，预后差等特点。迄今为止，除了肾脏替代治疗外，其尚缺乏其他有效的治疗方法。基因Klotho是Kuro等[1]在1997年研究原发性高血压时发现的抗衰老基因，主要表达于肾脏组织。Klotho蛋白分为膜型和分泌型两种。膜型Klotho蛋白是骨源性激素成纤维生长因子23的共受体，参与钙磷代谢过程；分泌型Klotho蛋白为一种体液因子，可发挥多种生物学作用[2]。多种因素如炎症因子、氧化应激、尿毒症毒素等可诱导Klotho表达下调[2]。研究显示，急性肾损伤是一种Klotho缺乏性疾病，肾脏缺血期Klotho表达即开始下调，随后出现血清Klotho蛋白水平下降，一直持续至再灌注后7 d仍未能完全恢复，补充Klotho蛋白可能具有保护作用[3]。然而，Klotho的具体作用机制仍未完全明确。基于此，本研究进一步探讨Klotho对缺血再灌注急性肾损伤的影响及可能的作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 60只SPF（无特定病原体）级雄性BALB/c小鼠，约 6～8周龄，体重20～25 g，饲养于SPF级实验动物房。小鼠Klotho蛋白ELISA试剂盒（武汉优尔生科技股份有限公司）；小鼠中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 （neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）ELISA试剂盒（美国R&D systems公司，MLCN20）；兔抗小鼠Klotho抗体（美国abcam公司，ab203576）；兔抗小鼠B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）抗体（美国 abcam 公司，ab182858），兔抗小鼠B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白（bcl-2-associated X protein，Bax）抗体（美国 abcam 公司，ab182733）；兔抗小鼠裂解的天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶（cleaved Caspase）-3抗体（美国Cell Signaling Technology公司，9661）；兔抗小鼠CD68抗体（美国abcam公司，ab125212）；逆转录试剂盒（日本TAKARA公司，DRR 037A）；real-time PCR荧光定量试剂盒（日本TAKARA公司，DRR081A）；Klotho蛋白（美国 R&D systems公司，1819-KL）；羊血清（上海碧云天生物技术有限公司）。PCR所需引物序列均采购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组及建模 60只小鼠按随机数字表法分为假手术+0.9%氯化钠注射液组（Sham+veh组）、假手术+Klotho补充组（Sham+kl组）、缺血再灌注急性肾损伤+0.9%氯化钠注射液组（I/R+veh组）、缺血再灌注急性肾损伤+Klotho补充组（I/R+kl组），每组各15只。各组小鼠再按不同的处死时相（术后第1、2、7天）随机分为D1（5只）、D2（5只）、D7（5只）3个亚组。采用双侧肾蒂夹闭法建立缺血再灌注急性肾损伤模型：小鼠以1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后剃毛、腹部皮肤消毒，沿腹正中线逐层剖开腹腔，以微血管夹夹闭双侧肾蒂，可以看到肾脏颜色由鲜红变为暗红，保温箱保温。小鼠肾脏缺血处理35 min后移开动脉夹，确认肾脏恢复灌注后，逐层缝合腹腔。Sham+veh组和Sham+kl组小鼠定位肾蒂但不夹闭，其余操作同上。Sham+kl组和I/R+kl组予再灌注后30 min腹腔注射360 ng Klotho蛋白注射液，Sham+veh组和I/R+veh组腹腔注射0.2ml 0.9%氯化钠注射液。

1.2.2 肾脏组织病理学检查 小鼠采用1%戊巴比妥钠（100 mg/kg）过量麻醉处死后，摘除双侧肾脏，去包膜，中性甲醛固定，石蜡包埋。石蜡切片行HE染色，光学显微镜下观察肾小管损伤情况。高倍镜下随机观察10个视野，肾小管损伤评分标准为：0分，＜10%的肾小管累及；1分，10%～25%的肾小管累及；2分，26%～50%的肾小管累及；3分，51%～75%的肾小管累及；4分，＞75%的肾小管累及。肾小管损伤表现包括小管扩张、管型形成、刷状缘脱落、细胞坏死等表现。

1.2.3 尿NGAL、血Klotho蛋白、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）水平检测采用代谢笼法收集小鼠24 h尿标本，采用眼球摘除法采集小鼠血液标本。尿NGAL、血Klotho蛋白水平采用ELISA检测。BUN、Scr水平采用酶法检测。

1.2.4 肾脏组织Klotho、Bcl-2、Bax mRNA表达水平检测 采用real-time PCR法。具体方法及相关引物序列设计参考文献[4]。各小鼠100 mg肾脏组织标本研磨后加入1 ml Trizol，提取总RNA。取1 μg RNA根据逆转录试剂盒说明书反转录为cDNA。采用SYBR GreenⅠ荧光法检测目的基因及管家基因（gapdh）的表达水平。采用10 μl扩增体系，每个样本重复3孔，以LightCycler 480型（德国罗氏公司）荧光检测PCR仪进行扩增。以gapdh作为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。

1.2.5 肾脏组织 Klotho、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达水平检测 采用Western blot法。各小组100 mg肾脏组织研磨后加入RIPA裂解液充分裂解，提取总蛋白，以BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性后取30 μg样本经SDS-PAGE凝胶电泳、转印至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉常温封闭2 h，分别孵育抗Klotho抗体（1：250）、抗 Bcl-2 抗体（1：500）、抗 Bax抗体（1：500）、抗 GAPDH抗体（1：1 000）、抗 Tubulin 抗体（1：1 000）、抗 Cleaved Caspase-3抗体（1：500）4℃过夜，经洗涤后以相应的荧光二抗常温孵育1 h，最后应用红外激光成像系统（美国Odyssey公司，LI-COR）采集图像。以GAPDH作为内参，采用Image-J图像分析系统半定量分析目的蛋白的相对表达水平。

1.2.6 肾脏组织Klotho、CD68蛋白表达情况观察 采用免疫组化法。肾组织标本经固定后制成石蜡标本，切成4 μm厚度的切片，石蜡切片后经脱蜡、水化、柠檬酸盐热修复抗原、0.3%双氧水溶液封闭后，以10%羊血清常温封闭 2 h，分别孵育抗 Klotho抗体（1：100）、抗CD68抗体（1：100）4℃过夜，洗涤后再以辣根过氧化物酶标记的二抗常温孵育1h，经冲洗、DAB显色、苏木精复染等步骤，最后于光学显微镜（德国Leica公司，DMLB双目显微镜）下观察Klotho、CD68蛋白的表达情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，两组比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sham+veh组与 I/R+veh组血 BUN、Scr、尿 NGAL水平及肾小肾损伤情况比较 I/R+veh组小鼠术后第1天BUN、Scr水平较Sham+veh组明显升高[（45.57±8.67）mmol/L 比 （8.18±2.17）mmol/L，（130.00±30.07）μmol/L 比（14.00±6.60）μmol/L，均 P＜0.05），分别升至 Sham 组的5倍及9倍以上，肾损伤标志物尿NGAL水平升高100倍以上[（7 766.46±1 249.78）ng/ml比（61.16±11.39）ng/ml，P＜0.05]，至术后第 7 天基本恢复正常，两组以上指标比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图1。肾脏组织HE染色显示，I/R+veh组小鼠术后第1天肾小管上皮细胞刷状缘消失，部分肾小管管腔扩张，小管细胞变性、坏死脱落，部分基底膜裸露，间质可见炎症细胞浸润，至术后第7天，肾小管损伤明显减轻，见图2（插页）。

2.2 Sham+veh组与I/R+veh组血Klotho水平及肾脏组织Klotho mRNA、蛋白表达水平比较 I/R+veh组小鼠术后第1天血Klotho水平较Sham+veh组下降[（669.89±136.51）pg/ml比（2 093.44±476.74）pg/ml，P＜0.05]，至术后第7天仍未能恢复正常[（703.71±116.67）pg/ml比（1 902.73±496.39）pg/ml，P＜0.05]。I/R+veh 组小鼠术后第1天肾脏组织Klotho mRNA、蛋白表达水平均较Sham+veh组下降（均P＜0.05），见图3。免疫组化显示，肾脏Klotho蛋白主要表达于肾小管上皮细胞，在缺血再灌注急性肾损伤时表达下调，见图4（插页）。

图1 Sham+veh组与I/R+veh组血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）水平比较（a：BUN水平比较；b：Scr水平比较；c：尿 NGAL 水平比较；与 Sham+veh 组比较，*P＜0.05）

图2 Sham+veh组与I/R+veh组肾损伤情况比较[a：肾脏组织光镜下所见（HE染色，×200）；b：肾小管损伤评分比较；*P＜0.05]

图3 Sham+veh组与I/R+veh组血Klotho蛋白水平及肾脏组织Klotho mRNA、蛋白表达水平比较（a：血Klotho蛋白水平比较；b：肾脏组织Klotho mRNA表达水平比较；c：肾脏组织术后第1天的Klotho蛋白表达电泳图；与Sham+veh组比较，*P＜0.05）

图4 Sham+veh组与I/R+veh组肾脏组织术后第1天的Klotho蛋白的表达光镜下所见（a：Sham+veh组；b：I/R+veh组术后第1天；免疫组化染色，×200）

2.3 Sham+veh组、Sham+kl组、I/R+veh 组、I/R+kl组肾脏组织Bax/Bcl-2 mRNA、蛋白及cleaved Caspase-3蛋白表达水平比较 与Sham+veh组比较，I/R+veh组小鼠术后第1、2天肾脏组织Bax/Bcl-2 mRNA表达水平分别升高约4.3倍、1.2倍（均P＜0.05），至术后第7天基本恢复正常。与I/R+veh组比较，I/R+kl组小鼠肾脏组织Bax/Bcl-2 mRNA表达水平于术后第1、2天分别下降约30%、20%（均P＜0.05）。同样地，I/R+veh组小鼠术后第1天肾脏组织Bax/Bcl-2蛋白表达水平与Sham+veh组相比升高3倍以上（P＜0.05），I/R+Klotho组小鼠术后第1天肾脏组织Bax/Bcl-2蛋白表达水平与I/R+veh组比较下降45%（P＜0.05）。此外，与Sham+veh组比较，I/R+veh组小鼠术后第1天肾脏组织cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高约7.3倍（P＜0.05），I/R+Klotho组小鼠术后第1天cleaved Caspase-3蛋白表达水平较I/R+veh组下降约62%（P＜0.05），见图5。

2.4 Sham+veh组、I/R+veh组、I/R+kl组肾脏组织CD68+细胞浸润情况比较 与Sham+veh组比较，I/R+veh组术后第1天肾间质（包括皮质和髓质）CD68+细胞浸润数量明显增多；I/R+kl组术后第1天肾间质（包括皮质和髓质）CD68+细胞浸润数量较I/R+veh组明显减少，见图 6（插页）。

图5 Sham+veh组、Sham+kl组、I/R+veh组、I/R+kl组肾脏组织B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白（Bax）/B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）mRNA、蛋白及裂解的天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶（cleaved Caspase-3）表达水平比较（a：Bax/Bcl-2 mRNA表达水平比较；b：Bax/Bcl-2蛋白表达电泳图及表达水平比较；c：cleaved Caspase-3表达电泳图及表达水平比较）

图6 Sham+veh组、I/R+veh组、I/R+kl组肾脏组织CD68+细胞浸润情况光镜下所见（a：Sham+veh组；b：I/R+veh组术后第1天；c:I/R+kl组术后第1天；免疫组化染色，×400）

3 讨论

随着医学技术的不断进步，急性肾损伤的病死率呈下降趋势，然而即使患者耐受了急性应激存活下来，其长期预后仍不容乐观[5]。近一半需要肾脏替代治疗的急性肾损伤患者出院后存在轻到中度的肾脏损害，3年终末期肾病发生率高达10%[6]。目前，肾脏替代治疗仍是急性肾损伤的主要治疗方法，然而接受肾脏替代治疗的患者其病死率仍然较高（49.7%）[5]。目前，越来越多的研究将注意力转向寻找新的急性肾损伤治疗靶点。本研究探讨Klotho在急性肾损伤中的作用机制，发现急性肾损伤时肾脏组织Klotho表达下降，补充Klotho蛋白具有抗凋亡和抗炎作用，可能是潜在的治疗靶点。

缺血再灌注急性肾损伤是临床上最常见的急性肾损伤病因之一。由于生理情况下近端小管氧分压较低而需氧量大的特殊生理结构，导致肾脏遭受缺血再灌注时，近端小管上皮细胞受损最为严重。急性肾损伤的病理生理过程复杂，研究表明血管损伤、骨架破坏、细胞凋亡、氧化应激、炎症均参与了急性肾损伤的发病过程。肾脏缺血时，ATP大量消耗，激活一系列Caspase家族蛋白酶，导致细胞凋亡。越来越多的证据提示细胞凋亡是急性肾损伤时肾小管上皮细胞早期死亡的主要方式，抑制凋亡过程可以保护肾脏[7-8]。主要有两种途径参与了细胞凋亡，包括死亡受体途径和线粒体途径。Bcl-2家族蛋白是线粒体途径凋亡的主要调节因子。其中，促凋亡因子（如Bax）和抗凋亡因子（如Bcl-2）之间的平衡决定着细胞的命运。研究显示，线粒体途径诱导的细胞凋亡在急性肾损伤的发生、发展中发挥重要作用，近端小管局部Bax基因敲除小鼠可以明显缓解肾脏缺血再灌注诱导的肾小管细胞凋亡，改善肾功能，减轻肾脏组织学损害[9]。

Klotho蛋白是由抗衰老Klotho基因编码的一种单向跨膜蛋白，主要表达于肾小管上皮细胞，并可分泌至血、尿、脑脊液中。作为抗衰老物质，Klotho已引起广泛重视，Klotho与疾病的相关性也成为热门研究，如Klotho在某些疾病（如肿瘤）中作为早期诊断标志物和治疗手段的可能性，Klotho基因多态性与人类寿命、骨质疏松、原发性高血压、脑卒中和冠状动脉性心脏病等疾病的相关性。Klotho在急性肾损伤时的具体作用机制尚不明确。有研究表明，Klotho可以通过调节丝裂原活化蛋白激酶[10]、炎症[11]等途径发挥抗凋亡作用。Klotho在急性肾损伤时的肾脏保护作用可能和其抗凋亡作用密切相关。本研究结果进一步支持了这一点。本研究发现，小鼠急性肾损伤后给予可溶性Klotho蛋白治疗，肾脏组织Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平、cleaved Caspase3蛋白表达水平同样于再灌注后24 h较未治疗急性肾损伤小鼠显著降低。其他研究也表明，抑制细胞凋亡过程可以明显改善肾脏损伤[12]。因此，外源性补充可溶性Klotho蛋白可以明显改善急性肾损伤时肾脏组织细胞凋亡状态，提示Klotho在急性肾损伤时的肾脏保护作用可能和其抑制细胞凋亡作用有关。

另一方面，单核/巨噬细胞的浸润与缺血再灌注所致急性肾损伤的发病相关。选择性清除单核/巨噬细胞可改善急性肾损伤[13]。因此，单核/巨噬细胞的浸润促进了肾损伤的发生、发展，抑制该过程可能可以防治急性肾损伤。本研究结果也证实急性肾损伤小鼠肾间质中CD68+细胞增多，提示存在巨噬细胞浸润。外源性补充Klotho蛋白可以减少急性肾损伤时CD68+细胞的浸润。其他研究也指出Klotho具有抗炎作用，包括可以抑制肿瘤坏死因子-α诱导的NF-κB活化和内皮黏附分子的表达[14]，可改善主动脉瓣膜炎症[15]。因此，Klotho在急性肾损伤时的肾脏保护作用还可能与其抗炎作用有关。

综上所述，缺血再灌注急性肾损伤时Klotho表达下调；急性肾损伤后，外源性补充Klotho蛋白可以发挥肾脏保护作用。Klotho蛋白可能是通过抑制细胞凋亡及炎症细胞的浸润等途径缓解急性肾损伤。