miR-486-3p与甲状腺乳头状癌关系的生物信息学研究

赵晓海 王成志 孔建兵 鲍跃兵 邱永伟 赖瑞南

甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌中最常见的病理类型，占甲状腺癌的80%以上，多见于年轻女性，患者常出现淋巴转移以及局部侵袭、复发[1-2]。肿瘤直径超过1 cm的PTC患者大多伴有中央区淋巴结转移，目前临床诊断困难，因此，治疗效果往往不及预期[3]。miR-486-3p作为一种常见的抑癌miRNA，在甲状腺癌中表达下调[4]。研究发现PTC细胞中miR-486-3p表达下调，能够促进NF-κB信号通路的活性，加速PTC细胞的侵袭，促进PTC疾病进展[5]。此外，miR-486-3p表达下调与乳腺癌前哨淋巴结的转移有关，能够作为乳腺癌淋巴转移诊断的分子标志物[6]。然而，目前鲜有关于miR-486-3p与PTC淋巴转移相关的分子机制的研究。基于此，本研究对PTC样本中miR-486-3p的差异基因进行生物信息学分析，并探讨其靶基因差异表达情况及临床意义，以期为其在PTC中的深入研究提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 数据来源和整理 检索肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/），下载PTC相关的mRNA表达数据，其中肿瘤样本502例、癌旁正常组织样本4例。

1.2 差异表达分析 使用limma R包对肿瘤标本与癌旁组织表达谱进行差异分析，选择log2FC绝对值＞1，P＜0.05为筛选条件。将数据进行可视化并导出相应图表。

1.3 差异基因功能及信号通路富集分析 使用ClusterProfiler R包对差异表达基因富集，随后进行基因本体（gene ontology，GO）分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）注释，绘制GO聚类图。使用ggplot2 R包绘制GO二级分类柱形图及KEGG注释统计图。

1.4 靶基因预测并与差异表达基因取交集 采用Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）与 miRDB（http://mirdb.org/）在线数据库预测与miR-486-3p存在结合序列的靶基因，将得到的miR-486-3p差异表达基因与两个数据库中预测到的靶基因取交集，绘制韦恩（Venn）图。

1.5 生存分析 保留TCGA数据集中包含生存资料的病例，根据中位数将患者分为基因高、低表达组。通过Survival R包对样本进行生存分析，绘制Kaplan-Meier生存曲线，并计算HR值。

2 结果

2.1 miR-486-3p差异表达基因分析 对502例肿瘤样本与4例配对样本进行差异分析，根据limma R包的分析结果，差异基因表达火山图见图1（插页），差异基因聚类分析热图见图2（插页）。结果显示，74个基因上调，25个基因下调，上调、下调差异最显著的各20个基因及相关信息见表1。

表1 筛选出的miR-486-3p差异表达基因

续表

图1 miR-486-3p差异表达基因的火山图

图2 miR-486-3p差异表达基因聚类分析热图

2.2 GO功能注释 使用ClusterProfiler R包对差异表达基因在生物学过程、分子功能、细胞成分、分子功能及细胞组分中的条目进行注释。选取P值最小前10个上下表达的功能条目进行标示，发现差异表达的基因多与细胞组织结构、形态发育、ERK1/2通路等功能调控相关，见表 2、图 3（插页）。

图3 差异表达基因GO富集二级类别柱形图

2.4 差异表达基因PTC患者的生存分析结果 将TCGA数据库中PTC患者的临床信息进行标准化处理后，发现miR-486-3p表达与患者的预后具有相关性，miR-486-3p低表达的PTC患者总生存率低于高表达的患者（P＜0.05），生存曲线见图 5（插页）。

图4 差异基因的KEGG注释统计图

图5 miR-486-3p高、低表达的PTC患者的生存曲线比较

2.3 差异基因的KEGG富集分析结果 PTC涉及相关通路主要有病毒感染、细胞周期、泛素化、蛋白水解、p53信号通路、细胞衰老等，见图4（插页）。

2.5 miR-486-3p靶基因预测与差异表达基因取交集 采用Targetscan、miRDB分别预测到miR-486-3p的5 263、941个靶基因，与miR-486-3p差异表达的15 128个mRNA取交集，得到包含689个基因的集合，见图6，差异最明显的前10个靶基因信息见表3。

3 讨论

miRNA是由19～24个核苷酸组成的非编码RNA，可以靶向互补mRNA来发挥调控基因的表达的功能，miRNA参与肿瘤的发生、发展和转移等过程，miRNA的模拟物已被证明在癌症的治疗中具有巨大潜力[7-8]。本研究对PTC中的表达谱进行生物信息学分析，并研究了miR-486-3p在PTC中的表达及其靶基因分布情况，以期为PTC患者的临床诊治提供帮助。

本次分析共筛选出99个差异表达基因，其中74个基因上调，25个基因下调，GO注释发现差异表达的基因多与细胞组织结构、形态发育、ERK1/2通路等功能调控相关，PTC差异通路主要涉及病毒感染、细胞周期、泛素化、蛋白水解、p53信号通路、细胞衰老等。研究表明多种miRNAs的表达失调可影响靶mRNA稳定性及介导翻译抑制。miRNA通过参与组织稳态、细胞周期、免疫功能等生物过程来介导PTC淋巴转移的发生[9]。除此之外，部分miRNAs可直接靶向p53来诱发BRAF突变，调控细胞周期进程、DNA修复和细胞凋亡从而参与PTC 的发生[9-10]。

表2 差异表达基因GO富集分析

图6 miR-486-3p差异表达基因与靶基因重叠的Venn图

本研究还发现miR-486-3p低表达的PTC患者总生存率高，即miR-486-3p高表达的PTC患者预后不良。miR-486-3p的靶基因预测结果显示LRP4、SRCIN1、HCN4、HPCAL4、SERPINA1、SLC34A2、SERINC2、GRM4、CTXN1、FIBCD1 可能是 miR-486-3p 在PTC中的靶点。Zhou等[11]学者研究发现LRP4作为潜在的PTC治疗靶标，可上调PI3K磷酸化水平，增强PTC的增殖、迁移和侵袭能力。Zhang等[12]报道了SRCIN1作为新发现的Src结合蛋白，可通过C端Src激酶结构域调节Src活性，SRCIN1通过介导细胞G0/G1周期停止及细胞分化，并增强肿瘤细胞生长、迁移和侵袭的能力。SLC34A2通过结合肌动蛋白的复合结构域，诱导PTC细胞侵袭，促进PTC细胞的转移能力[13]。上述基因均在PTC发生和转移中起到关键作用，作为miR-486-3p的靶基因，笔者猜想miR-486-3p可能会通过靶向调控上述基因的表达来参与PTC的发生、发展过程，其具体调控的分子机制可为后续研究的方向。除此之外，有报道称，miR-486-3p在多种恶性肿瘤中表达异常，miR-486-3p可作为肿瘤标志物，辅助肺癌早期诊断以及食管鳞癌、肌肉浸润性膀胱癌患者的预后评估[14-16]。miR-486-3p在喉鳞状细胞癌中会受到circFLNA的竞争性结合而表达下调，导致miR-486-3p调控FLNA蛋白的能力增强，从而介导肿瘤细胞迁移发生[17]。这些研究从多个方面辅证了本研究的结论，即miR-486-3p通过调控下游靶基因参与PTC的发生、发展。

表3 miR-486-3p靶基因预测与差异表达基因取交集

综上所述，本研究通过生物信息学方法综合分析了miR-486-3p的差异表达及临床意义，发现miR-486-3p可在PTC中参与调节肿瘤细胞的生物学功能，且低表达miR-486-3p的PTC患者预后不良，这提示miR-486-3p可能作为抑癌基因及生物标志物在PTC发生、发展中发挥重要作用。