甘薯渣多糖提取、分离纯化及抗氧化活性研究

陈树俊 崔 云

(山西大学生命科学学院，太原 030006)

甘薯是我国主要粮食作物之一，含有丰富的营养物质[1]，常用于生产甘薯淀粉类等产品，其产生的副产物甘薯渣难以处理，除极少部分用作饲料外，大部分被丢弃。但甘薯渣中含有许多未利用的可溶性膳食纤维类等多糖类物质[2]。多糖是一种生物活性物质，因为具有抗氧化[3]、抗衰老[4]、提高免疫力[5]等功效被广受关注。刘捷等[6]研究了水浴醇沉法提取红薯叶多糖，并测定其为β-吡喃糖化合物。但对甘薯渣多糖的研究鲜有报道。本实验用超声辅助提取甘薯渣多糖，对比得使用Sevag-酶法脱蛋白[7]，H2O2法脱色[8，9]，透析，DEAE-52纤维素分级[10]得SPRP-1，用SephadexG-100和紫外吸收光谱法[11]对SPRP-1纯度鉴定，并研究其抗氧化活性[12]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘薯(4月份)产自山西太原、牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶(80万u/g)、DEAE-52纤维素、SephadexG-100、DPPH等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SP-2000UV型紫外分光光度计，SC-3614低速离心机，HHS-21-4电热恒温水浴锅，SHZ-Ⅲ旋转蒸发仪，MS-H-S标准加热型磁力搅拌器，SB-5200DTD超声波清洗机，SCIENTZ-18N真空冷冻干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 提取

1.3.1.1 超声辅助提取

将新鲜甘薯洗净，打浆机2次破碎，3层纱布过滤2次得鲜甘薯渣，60 ℃条件下烘干10 h，粉碎过60目筛得甘薯渣样品。称1 g样品，适当条件超声辅助热水浸提后，4 000 r/min离心15 min，浓缩，加95%乙醇4 ℃醇沉过夜，4 000 r/min离心15 min，冷冻干燥得粗多糖。

1.3.1.2 多糖含量测定

参考马风伟等[13]方法，标准品为葡萄糖，以吸光度(y)和葡萄糖浓度(x)得标准曲线y=9.931 4x-0.051 6R2=0.999 1，测定多糖得率。

式中：m1为多糖质量/mg；m为样品质量/mg。

1.3.1.3 单因素实验

料液比：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；超声温度：30、40、50、60、70 ℃；超声功率：160、180、200、220、240 W；超声时间：40、50、60、70、80 min。每组实验重复3次，得各单因素对多糖得率影响。

1.3.1.4 响应面实验设计

以料液比，超声温度，超声功率，超声时间(x)，甘薯渣多糖得率(y)，根据Box-Behnken实验设计原理，结合单因素结果，采用四因素三水平响应面进行实验，优化超声波辅助提取甘薯渣多糖工艺，实验因素与水平见表1。

表1 响应面实验因素与水平

1.3.2 脱蛋白

1.3.2.1 蛋白质含量测定

参考杨玉芳[14]方法，标准品为牛血清白蛋白，以吸光度(y)和牛血清白蛋白浓度(x)得标准曲线y=0.004 6x+0.073 8，R2=0.999 3，测定蛋白质含量。

1.3.2.2 方法

Sevag法：取适量多糖溶液，加1/3体积(氯仿∶正丁醇=4∶1)氯仿-正丁醇溶液搅拌1 h，8 000 r/min离心20 min得上清液。重述操作直至无沉淀产生。

TCA法：取适量多糖溶液，加适量30%三氯乙酸溶液，4 ℃静置过夜，8 000 r/min离心20 min得上清液。

酶法：取适量多糖溶液，加2%木瓜蛋白酶，调pH 6.0，50 ℃水浴2 h，8 000 r/min离心20 min得上清液。

Sevag-酶法：在酶法基础上用Sevag法脱蛋白得上清液。

Sevag-TCA法：在TCA法基础上用Sevag法脱蛋白得上清液。

比较上述方法，计算蛋白质清除率及多糖损失率。

1.3.3 脱色

H2O2法：用1 mol/LNaOH溶液调溶液pH 8.5，加1/3体积30% H2O2溶液，50 ℃下脱色2 h，直至颜色不再改变，冷却后调pH 7.0。

活性炭法：将活性炭洗净过滤，120 ℃烘干10 h，冷却备用。取20 mL多糖溶液，加1.5%活性炭，60 ℃脱色2 h。

反胶束法：取4 mg/mL多糖溶液100 mL，沸水浴30 min，3 000 r/min离心3 min，取上清液40 mL加0.467gNaCl搅拌溶解，放置备用。取1 mL反胶束溶液和3 mL多糖处理液，混匀3 min后静置30 min，检测下层溶液。

比较上述方法，计算脱色率及多糖损失率。

1.3.4 透析

脱蛋白、脱色后多糖溶液还存在一些如无机盐等小分子杂质需要除去，将多糖溶液置于透析袋中，放入蒸馏水中透析72 h，每24 h换1次水，换3次。

1.3.5 分级

将多糖溶液浓缩上样到处理好的DEAE-52纤维素柱上，用蒸馏水、0.1～1 mol/LNaCl的Tris-HCl溶液依次洗脱，流速为1 mL/min，每6 min收集一管，用苯酚-硫酸法在波长490 nm处测定洗脱液吸光度，以吸光度(y)、管号(x)绘制洗脱曲线。洗脱液浓缩，冷冻干燥得精多糖。

1.3.6 纯度鉴定

SephadexG-100凝胶柱层析：配制6 mg/mL多糖溶液上样到处理好的SephadexG-100凝胶柱上，用蒸馏水洗脱，流速为0.3 mL/min，每10 min收集一管。用苯酚-硫酸法在波长490 nm处测定洗脱液吸光度，以吸光度(y)、管号(x)绘制洗脱曲线。

紫外吸收光谱法：配制1.0 mg/mL多糖溶液在200～500 nm范围内全波长扫描，观察其在波长260、280 nm附近的吸收峰。

1.3.7 体外抗氧化活性

1.3.7.1 清除DPPH自由基能力测定

参考宋佳敏[12]方法：测定2 mL无水乙醇和2 mLDPPH-乙醇溶液混合液在波长517 nm处的吸光度A0。配制不同质量浓度多糖溶液，加2 mL0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液避光静置30 min，测定吸光度A1，用无水乙醇代替DPPH-乙醇，测定吸光度A2。以VC为对照，计算清除率：

式中：A0为2 mL无水乙醇+2 mLDPPH-乙醇溶液吸光度；A1为2 mL样品溶液+2 mLDPPH-乙醇溶液吸光度；A2为2 mL样品溶液+2mL无水乙醇溶液吸光度。

1.3.7.2 超氧阴离子自由基清除能力测定

参考王丽波[15]方法：取预热后4.5 mL(pH 8.2、50 mmol/L)Tris-HCl溶液，加4 mL蒸馏水37 ℃水浴20 min，加0.5 mL 3 mmol/L邻苯三酚溶液水浴20 min，摇匀计时1 min，立刻测定在波长325 nm下吸光度值，每0.5 min测定1次，以10 mmol/L HCl溶液为对照，计算邻苯三酚自氧化速率v0。取不同质量浓度多糖溶液4 mL代替蒸馏水，以VC为对照，计算邻苯三酚自氧化速率v1，最后计算清除率：

式中：v0为邻苯三酚自氧化速率；v1为加多糖后邻苯三酚自氧化速率。

1.3.7.3 清除·OH能力测定

参考张昊[16]方法：取不同质量浓度多糖溶液1 mL，加1 mL6 mmol/LH2O2溶液、FeSO4溶液、水杨酸-乙醇溶液，40 ℃水浴1 h，在波长510 nm处测定吸光度A1，用蒸馏水代替H2O2溶液测定吸光度A2，用蒸馏水代替多糖溶液测定吸光度A0，计算清除率：

式中：A0为1 mL蒸馏水+1 mLH2O2溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸-乙醇溶液吸光度；A1为1 mL样品溶液+1 mLH2O2溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸-乙醇溶液吸光度；A2为1 mL样品溶液+1 mL蒸馏水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸-乙醇溶液吸光度。

1.3.8 数据处理

本实验均进行3次重复实验，采用Design-Expert 8.0.6、Origin8.0和excel软件作图分析。

2 结果与分析

2.1 多糖提取优化

2.1.1 单因素结果

由图1可知，增加溶剂用量，促进了溶质与溶剂反应，使多糖得率增加，过大溶剂用量可能导致分子间作用力减弱得率下降；随着超声时间延长，多糖得率先增加后降低，超过60 min后多糖内部结构遭到破坏得率下降，但在70～80 min，得率回升可能是超

图1 单因素实验结果

声破坏了其他大分子结构使其降解为小分子物质，悬浮在溶液中而使得率增大[17]；超声温度过高得率下降，原因是高温使得溶剂溶出，不利于多糖溶出[18]；超声功率过大使得其他活性物质散布于溶剂中，影响了多糖溶出。

2.1.2 响应面结果

由表2建立二次元线性回归方程：Y=5.91+0.22A+0.33B+0.25C+0.18D-0.27AB-0.11AC+0.12AD-0.27BC-0.41BD+0.17CD-0.41A2-0.54B2-0.52C2-0.21D2。

表2 Box-Behnken实验设计与结果

图2 各因素交互作用对SPRP得率影响的响应面图

表3 Box-Behnken 实验结果方差分析

2.1.3 各因素交互作用

由图2a可知，料液比和超声时间对多糖得率影响呈抛物线，随着超声时间的延长得率变化大于料液比，说明超声时间对多糖得率的影响较大；由图2d可知，超声时间和超声功率对得率影响呈曲面较陡的抛物线，两者对多糖得率的影响显著；由图2e可知，超声时间和超声温度对多糖得率影响呈先升高后平缓，两者交互作用显著。由图2f可知，得率随着超声温度增加先上升后平缓，但随着超声功率增大呈抛物线，交互曲面坡度较陡，说明两者交互作用显著。经Design-Expert 8.0分析可得最优工艺为料液比1∶17.30(g/mL)、超声时间57.05 min、超声功率208.66 W、超声温度60 ℃，多糖得率最优值为6.069%。综合考虑实际因素和实验准确性，最后确定料液比1∶17、超声时间57 min、超声功率209 W、超声温度60 ℃，进行3组重复验证实验，多糖平均得率为5.926%。

2.2 脱蛋白结果

由图3可知，综合考虑蛋白质清除率及多糖损失率，单独使用TCA法、Sevag法、酶法效果不及Sevag-酶法和Sevag-TCA法，因为两种方法合用可以起增效作用。但Sevag-TCA法多糖损失率比Sevag-酶法高7.82%，最后选Sevag-酶法脱蛋白，因为酶法中的木瓜蛋蛋白酶可将多糖周围的蛋白质降解[19]，在酶法基础上使用Sevag法可以使蛋白质清除率达到76.41%的同时将多糖损失率降到25.69%，时间短且处理次数少。

图3 脱蛋白方法对SPRP影响

2.3 脱色结果

由图4可知，活性炭法脱色率62.55%且多糖损失率47.26%，原因是活性炭特异性吸附一些有颜色的色素导致脱色率较低；反胶束法脱色率55.34%且多糖损失率44.38% ，但原料价格昂贵、所用试剂不能回收且脱色率比H2O2法低27.37%。H2O2法可以在脱色率可达82.71%且多糖损失率仅30.03%。因此选用H2O2法脱色，简单易操作且脱色效果较好。

图4 脱色方法对SPRP影响

2.4 分级结果

由图5可知，经DEAE-52纤维素分级后出现了3种较对称的峰，说明0～1mol/L NaCl的Tris-HCl溶液能较好地分离甘薯渣多糖，分别命名为SPRP-1、SPRP-2和SPRP-3。SPRP-1集中在第10～30管间，SPRP-2集中在第40～45管间，SPRP-3集中在第60～66管间，由于SPRP-2和SPRP-3峰较小即含量较少，接下来的实验中不予考虑。

2.5 纯度鉴定结果

由图6a可知，经Sephadex G-100洗脱后呈现单一对称峰，说明经一系列分离纯化的SPRP-1为相对分子质量分布均匀且较纯的多糖。从图6b可知，SPRP-1特征吸收峰出现在235 nm，在260 nm和280 nm处没有出现核酸和蛋白质的特征吸收峰，说明SPRP-1不含核酸和蛋白质等杂质的纯多糖。

2.6 抗氧化活性测定结果

由图7a可知，随着质量浓度增大，SPRP-1对DPPH自由基清除率逐渐增加，在70 μg/mL后清除率稳定在86%左右。计算得SPRP-1对DPPH自由基的IC50为29.928 μg/mL；从图7b可知，随着质量浓度增大，SPRP-1对超氧阴离子自由基清除率增长了44.49%，计算得SPRP-1对超氧阴离子自由基的IC50为0.537 mg/mL；从图7c可知，质量浓度在0.1-0.6 mg/mL范围内，SPRP-1对·OH清除率增长了69.68%，计算得SPRP-1对·OH的IC50为0.308 mg/mL。与VC对照可知甘薯渣多糖具有较好的抗氧化活性。

图5 DEAE-52洗脱曲线

图6 纯度鉴定实验结果

图7 抗氧化能力实验结果

3 结论

目前，甘薯渣中部分可溶性多糖类物质或提取多糖后剩余的不可溶性物质已被初步研究且得率较低，本实验通过超声辅助提取甘薯渣多糖最优工艺为：料液比1∶17(g/mL)、超声时间57min、超声功率209 W、超声温度60 ℃，甘薯渣多糖得率为5.926%。经Sevag-酶法脱蛋白，H2O2法脱色，透析，DEAE-52纤维素分级得含量较多的SPRP-1。且SPRP-1是一种相对分子质量分布均匀、不含蛋白质、核酸并具有较好抗氧化活性的纯多糖。