几种深海动物内脏油脂提取及DHA、EPA含量分析

张德勇 许晓路 陆 胤

(浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015)

DHA(4，7，10，13，16，19二十二碳六烯酸)和EPA(5，8，11，14，17二十碳五烯酸)是ω-3长链多不饱和脂肪酸a-亚麻酸的代谢产物，人类不能自身合成，依赖从食品中摄取。DHA和EPA对人体的心血管健康非常有益，能清理血液中的胆固醇和甘油三酯、软化血管、抑制血小板凝聚、抗血栓、舒张血管、调整血脂、升高HDL(高密度脂蛋白)、降低LDL(低密度脂蛋白)[1-3]。此外，研究显示它们对于改善脑功能和视力，甚至在对抗糖尿病、炎症、肾病、癌症等方面也有功效[4-7]。DHA被证实是脑细胞线粒体、微粒体和突触体的基本元件，直接影响人的生长发育，在大脑和视网膜中含量很高，是人体脑部、眼部各神经系统防御系统的主要成分[1]。

目前获取DHA、EPA的一个重要来源就是海洋动物，深海动物中的EPA和DHA的含量远高于其他普通食物。我国有漫长的海岸线，海洋水产品资源非常丰富。据统计，我国海洋鱼类约有1 700余种、沿海藻类约2 000种、虾蟹类近300种、经济软体动物约200种。这些海洋动物蕴含的不饱和脂肪酸资源数量非常可观。另外，与发达国家相比，我国对于这些丰富的海洋动物资源的开发利用还不充分，尤其在高附加值的深加工方面相对薄弱，在医药保健领域的规模化应用亟待提高。在以往关于DHA、EPA的提取研究中，更多集中在鱼类上，而对于非鱼类的深海动物如螃蟹、章鱼等未予重视[8, 9]。

不同于以往集中于鱼类研究，本研究选取了几种非鱼类的深海动物作为主要材料，首先从其内脏中提取油脂，然后用气相色谱法分析油脂中DHA、EPA的含量。旨在探究不同的海洋动物体内在多不饱和脂肪酸方面的营养价值差异，为开发医药或保健食品提供依据，以利于更科学合理地开发利用海洋动物资源。

1 材料与方法

1.1 试剂及生物材料

正己烷、甲醇、尿素、氢氧化钾等试剂均为分析纯，EPA-甲酯(C20∶5)、DHA-甲酯(C22∶6)标准品(纯度≥99%)，GC-2014气相色谱仪，6种海洋动物材料多为食品加工过程中产生的废弃内脏、残肢(表1)。

1.2 不同海洋动物内脏的油脂提取

鱿鱼内脏组织被随机切分成小份，每份约20 g，在恒温水浴箱中设置不同的温度进行隔水蒸煮，温度为90 ℃、45 min，期间不时进行摇动。蒸煮结束后6 000 r/min离心15 min以分离油相与水相，收集油相即为粗油脂[10]。

表1 6种海洋动物

1.3 粗油脂中的多不饱和脂肪酸富集

将尿素加入到95%的乙醇中，加热到45 ℃搅拌2 h，待溶液饱和后将其等量的分成三组并加入分别三组质量相同的10 g油脂，继续搅拌1 h；停止搅拌，自然冷却到室温；转入低温下静置数小时，以便包合反应充分进行；迅速在布氏漏斗上抽滤，液相移至梨形瓶中进行50 ℃旋转蒸发，除去乙醇，再进行水洗分液，有机相中加入少量无水硫酸钠去除水分，即得富集产物[11, 12]。

1.4 气相色谱法(GC)分析油脂中的DHA、EPA含量

1.4.1 气相色谱(GC)条件

参考以往在其他鱼油方面的研究，对气相色谱方法进行优化[8, 13-15]。气相色谱基本条件为：色谱柱Agilent lechnologies，inc. 19091N-133(30 m×0.250 mm，0.5 μm)；柱温箱温度起始温度180 ℃，以10 ℃/min 升至220 ℃，再以8 ℃/min 升至250 ℃，保持13 min；进样口温度250 ℃；检测器温度270 ℃；载气氮气(≥99.99%)流速1.0 mL/min，空气450 mL/min；氢气40 mL/min；进样量1.0 μL；分流比：20∶1。

1.4.2 标准品处理

以过滤后的正己烷配制EPA，DHA标准标准溶液。精确移取EPA-甲酯、DHA-甲酯标准品用容量瓶配制。一号容量瓶中为混合EPA、DHA标准溶液各2 mg/mL，采用倍比稀释法配置系列浓度的混合标准样，见表2。

1.4.3 样品的处理

为与标准品一致，油脂样品也要进行甲酯化反应，即在碱性条件下与甲醇发生反应。精确称取油脂0.5 g于试管中，移取5 mL正己烷溶解试样。另外称取KOH 2.8 g溶解于水，转入100 mL的容量瓶中，再称取1.6 g甲醇加入其中，最后加水定容。再移取2 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液加入至各个试管中。封盖后振摇1 min，加蒸馏水至试管颈部。弃去下层液体，再反复用少量蒸馏水进行洗涤并用吸管弃去水层，直至洗至中性，若正己烷层浑浊，以4 000 r/min离心5 min。吸取各个正己烷层用于上机测定。

表2 DHA和EPA标准品配制

1.4.4 样品的进样、测定

进样操作按照气相色谱的操作要求进行。进样时用微量进样针准确吸取1.0 μL EPA-甲酯、DHA-甲酯的混合标样或者待测试样准备进样，然后启动工作站上的进样功能键迅速进样。启动后进行色谱数据记录。

1.4.5 精密度分析

用相对标准偏差(RSD)等来分析精密度。具体为选一份鱿鱼油脂样品为材料，重复进样5次，测得的EPA的峰面积响应值，计算其相对标准偏差RSD。

1.4.6 回收率分析

精确称取鱿鱼油脂样品，分9份，每份0.15 g，分别加入不同量的10 mg/mL 浓度的EPA、DHA标准品，制备成低(EPA-甲酯900 μL、DHA-甲酯1 500 μL)、中(EPA-甲酯1 125 μL、DHA-甲酯1 875 μL)、高(EPA-甲酯1 350 μL、DHA-甲酯2 250 μL) 3个浓度水平。将上述材料与油脂样品用正己烷定容至25 mL。然后，按甲酯化步骤处理、测定。计算回收率及相对标准偏差。

1.5 数据分析

对气相色谱法获得的出峰时间和峰面积进行计算和记录。然后统计不同种类油脂中的EPA和DHA含量，并分析不同种类之间的差异，组间差异在SPSS (V11.5)软件中进行One-way ANOVA分析，以α=0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同动物内脏的粗油脂得率

隔水蒸煮法对6种动物废弃内脏进行提取，均成功提取到粗油脂，其呈浅黄色，气味微腥，无酸败味。进一步计算出油率，出油率以油脂占内脏的质量比表示。各物种的出油率如表3所示。可以看出，这几种动物内脏的出油率在0.72%～6.23%之间，不同种类的差异性很大，尤其以青蟹的出油率最高，其次为鱿鱼、象拔蚌等也较高，鲍鱼最低。

表3 各种动物内脏材料的出油率

2.2 高不饱和脂肪酸富集

在尿脂比2∶1、结晶温度0 ℃、结晶时间18 h的条件下，蒸发温度采用40、45、50、55 ℃分别得到57%、66%、69%和72%的富集纯度。EPA和DHA的总纯度随反应温度的升高而增大，在反应温度为55 ℃时，省去了保护操作，效果仍较为理想。但温度升至60 ℃时，富集物颜色明显加深，疑似出现部分变质，故以55 ℃最佳。

2.3 EPA和DHA气相出峰特征及回归方程建立

如图1所示，EPA-甲酯的出峰时间约在10 min后，DHA-甲酯的出峰时间约在接近14 min时。分别进样1.0 μL条件下得到色谱图，计算峰面积响应值，然后分别以质量浓度(C)为横坐标和峰面积响应值(A)为纵坐标，建立标准曲线和回归方程。EPA-甲酯、DHA-甲酯分别在2000 μg/mL以内的范围内时，色谱峰面积与EPA、DHA甲酯含量线性关系良好，最终建立两个线性回归方程。

YEPA=5 971.3x+3.53；R2=0.999 1

(1)

YDHA=5 119.5x+3.95；R2=0.999 3

(2)

式中：x值为EPA-甲酯或DHA-甲酯质量浓度/μg/mL，Y值为峰面积值。

图1 EPA-甲酯和DHA-甲酯的吸收峰

2.4 气相色谱法的精密度与回收率

精密度的结果是连续进样5次，所测得的EPA的峰面积响应值分别为7.12、6.99、7.10、6.90、7.12(×105)，平均值7.05(×105)，相对标准偏差RSD为0.98%，可见RSD小于1%，反映仪器和方法的精密度较为理想。

加标回收实验结果见表4和表5。经计算，EPA甲酯平均回收率是100.80%，RSD为1.86%；DHA平均回收率为98.84%，RSD为0.95%。可以看出，本方法规定条件下，2种脂肪酸的样品回收率测试平均回收率在98.84%～100.80%，相对标准偏差小于2%，符合常规要求。

表4 EPA加标回收实验结果

表5 DHA加标回收实验结果

2.5 不同种类油脂中的EPA和DHA含量

根据前面优化的气相色谱条件，对各类粗油脂甲酯化后的样品进行直接检测，如果低于检测限则富集后再测定。检测结果(以EPA或DHA的甲酯形式计)见表6。EPA含量从高到低依次为青蟹、鱿鱼、象拔蚌、鲍鱼、乌贼和梭子蟹。DHA的含量从高到底的品种依次为青蟹、鲍鱼、乌贼、梭子蟹和象拔蚌。这些动物在这两种不饱和脂肪酸的含量上差异悬殊，高的达到37.02 μg/mL，低的仅为0.15 μg/mL。

表6 粗油中EPA和DHA浓度测定结果

2.6 EPA、DHA含量与海水深度关系分析

为了分析油脂中的EPA和DHA含量是否与动物所活动的海水深度之间是否有一定的关联性，我们调查了这些种类的海洋动物所栖息活动的海洋深度特征，按照从浅到深以次为：鲍鱼(以5 m计)、象拔蚌(以10 m计)、鱿鱼(以45 m计)、青蟹(以55 m计)、梭子蟹(以200 m计)、乌贼(以500 m计)。如图2所示，随着海水深度的逐渐加深，EPA的含量先是上升，但到达一定程度后又转而下降，因此二者并非简单的正相关关系，而是以中间某个深度时EPA含量最高，即活动于约55 m深度的青蟹。如图3所示，DHA的含量与海水深度之间也呈现类似现象，DHA含量随海水深度的加深呈现先升后降的过程，以约45 m深度的鱿鱼含量最高。这一规律与以往在海洋鱼类上的检测到的情况很相似[8, 9]。

图2 EPA含量与动物所处海水深度的相关性

图3 DHA含量与动物所处海水深度的相关性

3 结论

本研究优化了同时测定EPA和DHA的气相色谱法，简便高效，分析时间短、定量准确、结果重现性好，精密度和回收率均较为理想。本研究共采用了6种来自野生海洋动物的内脏或残肢等废弃物为材料，进行了油脂的提取，且均检测到了DHA和EPA，显示了这些废弃物有重要的资源开发利用价值。不同种类的海洋动物，出油率不同，油脂中的DHA和EPA含量也差别悬殊。在所检测的6种动物中，出油率方面以青蟹最高，其次为鱿鱼；而油脂中又分别以鱿鱼和青蟹中的DHA和EPA含量最高。因此，综合而言，这两种动物最适合作为DHA和EPA的获取来源。另外，对这几种海洋动物油脂中的DHA和EPA含量与其生活的海水深度之间的关系分析揭示了一个特点，即不论EPA还是DHA在油脂中的含量均表现为生活于中等深度海水的生物中含量最高，过浅或过深的区域的种类反而是偏低的。不能简单地认为深度越深，多不饱和脂肪酸的含量一定越高，这一结论为筛选富含EPA或DHA来源的海洋动物提供了参考。