抗原85复合物的致病机制及其在结核病疫苗研制中的应用进展

梁正敏 王元智 刘一朵 周向梅

结核分枝杆菌(MTB)是一种在细胞内生存的细菌，其通过呼吸道进入宿主后，被肺泡巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、上皮细胞所包围。MTB的许多毒力因子，如热休克蛋白65(Hsp65)、Hsp70、阿拉伯糖甘露糖脂(LAM)等，与巨噬细胞或树突状细胞表面受体结合，有利于MTB进入细胞[1]。MTB在使用不同策略进入细胞的过程中，其分泌蛋白如MPT64、早期分泌靶抗原6(ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)和抗原85(Ag85)复合物等起着重要作用。Ag85复合物是MTB的主要分泌抗原，在MTB的致病性中起重要作用。Ag85复合物可与纤维连接蛋白和弹性蛋白结合并介导MTB的黏附和侵袭，具有分枝菌酸转移酶活性介导MTB的细胞壁合成。此外，Ag85分子能刺激辅助性T淋巴细胞(Th)1细胞产生多种细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TFN-α)、γ干扰素(IFN-γ)等。由于具有这些特性，Ag85复合物在结核病诊断和疫苗研发[2]、抗结核药品[3]研发及免疫治疗[4]等方面都具有重要的应用潜力。

一、Ag85作为毒力因子的作用

Ag85蛋白家族包括Ag85A(相对分子质量31 000)、Ag85B(相对分子质量30 000)、Ag85C(相对分子质量31 500)成员。在分泌蛋白中，Ag85是MTB培养液中最常见的分泌蛋白。Ag85A和Ag85B占总培养液蛋白的60%。此外，Ag85A、Ag85B和Ag85C在氨基酸和基因水平上具有广泛的交叉反应性和同源性[2]。Ag85蛋白家族成员都能结合纤维连接蛋白，与MTB的侵袭有关。无论在抗体介导的体液免疫反应还是T细胞介导的细胞免疫反应中，Ag85分子在MTB自然感染和实验动物感染模型中都具有很强的免疫原性。在上述3种Ag85家族成员中，Ag85B是含量最多的一种，也是MTB的主要胞外蛋白，培养3 d就能被检测到。Ag85B、Ag85A、Ag85C分别以约3∶2∶1的比例分泌。Ag85复合物除了在培养液中表达，也可在人单核细胞中表达，这些蛋白定位于吞噬体和分枝杆菌细胞壁[5]。

1.结合纤维连接蛋白、弹性蛋白及纤溶酶原：纤维连接蛋白是存在于血浆和组织中的一类高分子量糖蛋白，与细胞运动、黏附、细胞形态调控、吞噬功能等相关。Ag85A和Ag85B能以高亲和力结合血浆纤维连接蛋白[6]。研究发现，Ag85蛋白是一种应激敏感黏附素，当肺脏细胞暴露在高剪切应力条件下或在血源性传播期间有利于MTB吸附在肺部[7]。除了纤维连接蛋白，弹性蛋白也是MTB入侵的重要配体。弹性蛋白是细胞外基质中的一种重要蛋白，对许多组织如皮肤、肺、血管的弹性状态起着至关重要的作用。Ag85能够通过作用于弹性蛋白基序AAAKAA(K/Q)(Y/F)结合弹性蛋白及其前体[8]。此外，Ag85还能与人纤维蛋白溶酶原结合，使纤维蛋白溶酶原被激活成纤溶酶，使MTB具有分解胞外基质和基底膜蛋白的能力，从而导致组织损伤[9]。因此，Ag85复合物与纤维连接蛋白和弹性蛋白的结合介导了MTB对巨噬细胞的附着和侵袭，与纤维蛋白溶酶原的结合导致组织发生病理损伤。

2.分枝菌酸转移酶活性：Ag85复合物能催化海藻糖单酸盐中的分枝菌酸转移生成阿拉伯半乳聚糖或海藻糖霉菌酸酯。这些脂质对分枝杆菌细胞的表面组分具有重要作用。Ag85A、Ag85B和Ag85C均可作为分枝菌酸转移酶参与分枝杆菌细胞壁组装的最后阶段，如催化脂肪酸的转移，参与分枝杆菌细胞表面组分的生物合成[10]。因此，Ag85复合物也属于细胞壁抗原。

3.毒力：Ag85复合物在MTB发病机制中起着重要作用。MTB进入细胞后，Ag85通过与黏膜表面的纤维连接蛋白和弹性蛋白等结合，这种相互作用有助于细菌进入宿主细胞的吞噬体。Ag85A、Ag85B和Ag85C作为免疫显性蛋白，可明显诱导Th1细胞产生IFN-γ和TNF-α等细胞因子[11-13]。与亲本株相比，Ag85A缺失菌株在人(THP-1)和小鼠(J774.1A)巨噬细胞系中的生长速度明显下降，而Ag85B缺失菌株的生长速率无明显影响[14]，Ag85C缺失菌株的转移酶活性降低了40%，但在细胞内的生长速率未改变[15]。因此，比较Ag85A、Ag85B和Ag85C缺失菌株在细胞内的生长情况，Ag85A的毒力可能强于Ag85B和Ag85C。

二、Ag85作为一种免疫显性抗原在候选疫苗中的作用

BCG是目前被广泛用于预防结核病的疫苗，它能有效保护儿童免受MTB感染。然而，BCG对成年人的保护效力范围为0～80%[16]。因此，研制有效的结核病疫苗是未来的重要研究方向。许多MTB抗原已被用于结核病疫苗的设计，其中，Ag85复合物是免疫原性最好的抗原之一。多种用Ag85构建的重组BCG疫苗、蛋白佐剂疫苗、病毒载体疫苗在研发中或已进入临床试验阶段(表1)。尽管3个Ag85蛋白家族成员之间存在明显的序列同源性，但它们的T细胞表位存在差异[17]，氨基酸241～260和261～280是Ag85B和Ag85A交叉反应的T细胞表位，而接种了Ag85C DNA疫苗的小鼠的脾细胞不识别这些区域。此外，MTB感染的C57BL/6小鼠(对Ag85A和Ag85B多肽反应较强)或BALB/c小鼠(仅对Ag85A多肽反应)的脾细胞对上述3种抗原的识别反应不一样[18]。因此，Ag85A或Ag85B可能比Ag85C更具有免疫原性。在众多进入临床试验阶段或正在研发的结核病候选疫苗中，主要选用Ag85A或Ag85B。Ag85A是最早进入新型疫苗临床试验阶段的单一抗原[19]。在3个Ag85蛋白家族成员中，Ag85B是研发结核病疫苗使用频率最高的抗原，这可能与Ag85B是培养液中含量最多、分泌最早的抗原相关，也可能与早期使用Ag85A的新型结核病疫苗首次进入临床试验的免疫效果不佳有关。但Ag85B与Ag85A的免疫原性相比，目前尚无明确证据显示其更优。

1.Ag85在重组BCG疫苗中的作用：rBCG30是早期构建的重组BCG疫苗。尽管rBCG30在动物模型上显示出很好的免疫原性和保护性，但Ⅰ期临床试验结果显示其免疫原性与野生型BCG相比无明显差异[20]。重组BCG疫苗Aeras-422(过表达Ag85B、Ag85A、Rv3407，表达产气荚膜溶血素O)能为小鼠提供抗MTB感染保护作用，但Ⅰ期临床试验发现2名接种疫苗的志愿者出现了水痘带状疱疹病毒感染，推测Aeras-422免疫后可能会重新激活潜伏的疱疹病毒，导致Ⅰ期临床试验提前终止[21]。此外，与野生型BCG相比，过表达Ag85A的重组BCG疫苗rBCG::Ag85A能诱导小鼠产生更高水平的抗原特异性抗体和细胞因子IFN-γ，能提供小鼠更强的抗MTB感染能力[22]，且比其他表达多抗原的rBCG具有更好的保护效果[40]。但也有研究显示，过表达多阶段抗原的重组BCG疫苗比野生型BCG疫苗或单基因rBCG能诱导小鼠产生更强、更持久的抗MTB感染保护作用[23-24]。但它们的临床免疫保护效果有待进一步研究。

重组BCG疫苗主要用于替换BCG，构建的重组BCG过表达优势抗原。研究表明，表达多种抗原的重组BCG比表达单一抗原的重组BCG的免疫效果更好；但也有可能存在安全性问题，如Aeras-422[20]。重组BCG既具有亲代的免疫优势，又弥补了亲代的不足并改善保护性，而且易于纳入免疫体系中推广使用。相对于其他类型的候选疫苗，具有无可比拟的优势，受到广泛重视。到目前为止，rBCG30和AERAS-422两种重组BCG己进入临床试验阶段，但由于缺乏有效性或存在不良反应，两种重组BCG疫苗的临床试验已经停止。而重组BCG疫苗VPM1002(用李斯特菌溶血素代替尿素酶基因)已进入Ⅲ期临床试验[41-42]。因此，不同的疫苗设计策略决定了所研制疫苗的免疫保护机制和保护效果的不同。

2.Ag85在蛋白佐剂疫苗中的作用：蛋白佐剂疫苗主要用于BCG初次免疫后的加强免疫。目前进入临床试验的蛋白佐剂疫苗有H1∶IC31、H1∶CAF01、H4∶IC31、H56∶IC31和GamTBvac。GamTBvac(Ag85A，ESAT-6-CFP-10)在小鼠和豚鼠的MTB感染模型中具有明显的抗MTB感染保护作用[43]。最近，GamTBvac的Ⅰ期临床试验显示其具有良好的安全性和免疫原性[11]。H1(Ag85B-ESAT-6)融合蛋白是最早研发的蛋白佐剂疫苗，现已进入Ⅱ期临床试验，结果显示在未感染和MTB感染的青少年中，H1具有安全性和免疫原性[30]。该疫苗能诱导不同类型的人群，如接种过BCG的健康志愿者、既往结核感染或结核潜伏感染人群，产生长期持久的抗原特异性T细胞反应[44]。

表1 用Ag85复合物构建的正在研发的或已进入临床试验阶段的疫苗

由于H1疫苗中的ESAT-6会干扰γ干扰素释放试验，学者们更愿意将ESAT-6用作诊断抗原。HyVac4(Ag85B-TB10.4，H4)是用TB10.4抗原取代ESAT-6的一种新型融合蛋白，Ⅰ期临床试验证实H4∶IC31具有良好的安全性和免疫原性，低于50 μg的H4剂量诱导产生的多功能CD4+T细胞更多，免疫记忆能持续182 d[45]。但Ⅱ期临床试验结果发现，H4∶IC31接种未改变QFT(QuantiFERON TB-GOLD，一种结核感染的检测方法)的初始转化，对QFT转化率无明显影响[30]。

相对于H1和H4疫苗，H56(Ag85B、ESAT-6、Rv2660c)疫苗增加了结核潜伏感染相关抗原Rv2660c，食蟹猴免疫H56∶IC31后可加强抵抗MTB的潜伏感染[46]。H56∶IC31疫苗免疫感染MTB和未感染MTB成年人证实其具有良好的安全性和耐受性，并能诱导持久的抗原特异性CD4+T细胞反应[32]。最近的临床试验发现，用5、15、50 μg的H56免疫QFT-和QFT+志愿者后均能诱导抗原特异性多功能CD4+T细胞，3组剂量间差异无统计学意义。但ESAT-6仅在QFT-参与者中具有免疫原性。疫苗剂量和免疫方案对QFT+和QFT-个体的适用性需要进一步的临床试验研究验证[32]。由于MTB是经呼吸道传播，呼吸道黏膜免疫是一种有潜力的免疫途径。研究发现，用H56∶CAF01对小鼠进行呼吸道黏膜免疫可明显增加持久的肺脏驻留T细胞(Trm)的数量，但未改善肺部抵御MTB感染的能力，提示肺部Trm在疫苗控制MTB感染中的局限性[47]。相对于液体疫苗剂型，固体疫苗剂型，例如喷雾干燥，能提供更好的储存稳定性和减少对冷链设施的依赖。研究发现，H56∶CAF01经喷雾干燥后仍能保留其免疫原性[48]。与H56的构建方法相似，最近有研究将融合蛋白Ag85B-ESAT-6和结核潜伏感染相关抗原HspX与佐剂氢氧化铝和poly I∶C免疫小鼠后可诱导高水平抗原特异性抗体和细胞因子IFN-γ、白细胞介素2(IL-2)和TNF-α[49]。但其抗感染保护效力有待进一步研究。

3.Ag85在病毒载体疫苗中的作用：MVA85A(牛痘病毒表达Ag85A)是第一个进入临床试验阶段的新型疫苗。MVA85A 能显著诱导T细胞分泌抗原特异性IFN-γ，接种24周后，IFN-γ水平比仅免疫BCG的人高5～30倍[50]。MVA85A免疫接种过BCG的婴幼儿后显示其具有良好的耐受性，并可诱导明显的细胞免疫应答，但对婴幼儿结核病缺乏保护效果[19]。此外，对感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的新生儿接种MVA85A可引起早期抗原特异性免疫反应，不干扰或增强随后接种BCG的免疫原性[51]。虽然临床试验结果显示MVA85A免疫后对婴幼儿的抗MTB作用无明显影响，但科学家们并未就此放弃MVA85A。最近的一个临床试验通过改变免疫途径、免疫次数和免疫人群再次评估MVA85A的有效性。研究人员分别用呼吸道黏膜免疫-皮内免疫、皮内免疫-呼吸道黏膜免疫、皮内免疫-皮内免疫3种方案进行接种免疫过BCG的成年人。结果显示，只有皮内免疫-呼吸道黏膜免疫方案诱导了明显的Ag85A介导的细胞免疫应答。黏膜免疫-皮内免疫方案耐受性好，而皮内免疫-黏膜免疫方案会引起短暂的明显的呼吸道不良反应。雾化吸入黏膜免疫能诱导明显的黏膜和全身的Ag85A特异性细胞免疫反应，但这种免疫反应是否与抗感染保护能力相关还有待临床证实[52]。有趣的是，最近临床研究发现MVA85A可明显增强ChAdOx1 85A(黑猩猩腺病毒载体表达Ag85A)诱导的细胞免疫反应[27,53]，给控制结核病带来了新的希望。

Ad5Ag85A是一种表达Ag85A的复制缺陷型5型腺病毒(Ad5)载体疫苗，实验动物模型研究结果显示Ad5Ag85A能明显促进BCG的保护作用，且通过呼吸道黏膜免疫能提供更好的保护；临床试验结果显示Ad5Ag85A是安全的，能诱导接种BCG的青少年产生抗原特异性多功能T细胞[26]。但有学者认为机体内预先存在的腺病毒载体的抗体可能会中和腺病毒载体从而影响疫苗的效果[54]。但Ⅰ期临床试验证实预先存在的Ad5抗体并没有抑制疫苗诱导的T细胞免疫反应[26]。尽管如此，Ad5Ag85A尚未进行进一步的临床试验。

为了解决机体预先存在的抗腺病毒载体影响疫苗免疫原性的问题，新的病毒载体如猿类腺病毒或猩猩腺病毒被认为是下一代病毒载体疫苗的候选载体[55]。ChAdOx1 85A是一种新型的表达Ag85A的黑猩猩腺病毒载体疫苗。研究发现，尽管呼吸道黏膜免疫ChAdOx1 85A能诱导肺产生较强的免疫反应，但不能提供抗MTB感染保护；相反，用鼻内或皮内免疫ChAdOx1.85A(初次免疫)-MVA85A(二次免疫)均能诱导明显的免疫反应，并能提高BCG的抗感染保护作用。结果表明，BCG-ChAdOx1 85A-MVA85A免疫方案具有明显的抗感染保护作用[53]。最近的临床试验用ChAdOx1 85A免疫幼时接种过BCG的成年人，用MVA85A进行二次加强免疫。结果显示，ChAdOx1 85A能诱导明显的Ag85A特异性CD4+和CD8+T细胞反应，但用ChAdOx1 85A进行二次加强免疫并未加强这种免疫反应。而MVA85A二次加强免疫可促进ChAdOx1 85A诱导的免疫反应[27]。可能由于体内诱导产生的腺病毒载体免疫反应影响了疫苗的免疫原性，二次免疫用异源病毒载体能起到更好的免疫保护作用。

ChAdOx1 85A和MVA85A及Ad5Ag85A腺病毒载体疫苗都表达单一抗原Ag85A。Ad35-TBS(AERAS-402)则是一种表达三种抗原(Ag85A、Ag85B和TB10.4)的复制缺陷型35型腺病毒载体疫苗。对免疫过BCG的志愿者用AERAS-402进行加强免疫，结果显示AERAS-402可以明显增强BCG免疫后的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞反应[56]。但也有研究表明AERAS-402疫苗诱导的CD8+T细胞在多数情况下不能识别受MTB感染的细胞，提出检测疫苗诱导的多功能T细胞可能并不能反映这些细胞识别MTB感染细胞的能力[57]。此外，有研究发现对肺结核患者或曾患肺结核者免疫AERAS-402也能诱导较强的免疫应答[58]。最近，研究发现表达优势抗原Ag85A和Ag85B 的仙台病毒载体疫苗SeV85A是一个有应用潜力的结核候选疫苗，SeV85A免疫小鼠后可诱导抗原特异性CD4+和CD8+T细胞反应，明显增强BCG的免疫保护作用[29，59]。除了优化抗原组合，有研究者尝试通过构建双价疫苗[60]或与DNA疫苗联合使用[61]来提高病毒载体疫苗的免疫效果。

4.Ag85在DNA疫苗中的作用：作为第三代疫苗的DNA疫苗相对于其他类型的结核病疫苗，如蛋白佐剂疫苗、病毒载体和重组BCG疫苗，是一种较新的结核病预防技术。DNA疫苗一般通过肌内注射途径到达体内，然后由抗原提呈细胞(如巨噬细胞)内吞DNA到酸性囊泡中，随后运输到细胞核。最后，利用真核细胞进行抗原表达和蛋白翻译，产生保护性免疫应答。尽管DNA疫苗具有良好的应用前景，但到目前为止，尚未有结核DNA疫苗进入临床试验阶段。

由于DNA疫苗表达单一MTB抗原对抗MTB感染的作用有限，越来越多的多抗原DNA疫苗进入人们的视野。早期构建的含多阶段抗原的DNA疫苗pAEH(表达Ag85B、ESAT-6和HspX)在实验动物模型上显示出较高的免疫原性，并具有抗感染保护作用[38]。但目前尚无进一步的研究。最近，Su等[37]构建含多抗原Ag85A、Rv3425和潜伏感染相关抗原Rv2029c的DNA疫苗A39，在MTB感染前，A39可为小鼠提供保护性免疫。此外，感染后接种A39可抑制MTB的再活化，明显降低了小鼠肺部和脾脏的细菌数量。此外，有研究发现DNA疫苗Hsp65-Ag85B比DNA疫苗Hsp65-ESAT6能诱导更强的T细胞免疫应答，具有更高的保护效力[62]。此结果提示抗原的组合对于构建多抗原疫苗的重要性。最近研究发现，将表达相同抗原Ag85A 和Ag85B的DNA疫苗与病毒载体疫苗进行联合免疫比单独免疫DNA疫苗或病毒载体疫苗能诱导更高水平的T细胞免疫反应，提供更好的抗感染保护作用[61]。此外，有研究表明将表达Ag85B的重组BCG和DNA疫苗进行联合免疫能增强CD8+T细胞的免疫应答，可能有助于克服BCG的局限性[39]。

综上所述，Ag85复合物主要通过与纤维连接蛋白、弹性蛋白结合介导MTB在宿主细胞的黏附和侵袭，通过其分枝菌酸转移酶活性介导MTB的细胞壁合成。Ag85复合物作为毒力因子具有较强的免疫原性，其中，Ag85A和Ag85B的免疫原性更优。但是不同的疫苗类型、抗原的组成、佐剂、免疫途径、接种人群的年龄及是否感染MTB或HIV等均会影响疫苗的免疫保护效果。H1∶IC31和H4∶IC31在动物模型上显示出良好的免疫保护作用，但进入临床试验后其免疫效果却不理想。经过优化抗原组成的H56∶IC31在临床试验中显示出良好的免疫原性，但需要进一步研究其对QFT+和QFT-个体的适用性。MVA85A对婴幼儿的免疫保护作用不佳，但与ChAdOx1 85A联合免疫成人后可加强ChAdOx1 85A的免疫原性。因此，疫苗抗原的选择和免疫方案的优化及其对不同类型人群的适应性等因素对疫苗的免疫效果尤为重要。尽管近年来体液免疫反应逐渐引起研究者们的注意[63]，但目前大多数疫苗的设计靶标仍然是细胞免疫反应。对于Ag85、ESAT-6等抗原，T细胞介导的免疫反应较抗体介导的免疫反应对抗MTB感染可能更有效。仅使用主要诱导体液免疫反应的铝佐剂未能诱导明显的抗感染免疫应答[64]。而使用主要诱导细胞免疫反应的蛋白佐剂疫苗[44]或病毒载体疫苗[27，58]能发挥较好的抗感染保护作用。可能多糖类抗原以诱导体液免疫反应为主发挥抗感染作用[65-66]，但尚需进一步的临床研究证实。