HPLC 法测定血竭含量的不确定度评定

黄志业，张家乐，袁焕合

广东省药品检验所，广州 510000

测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相关联的参数，是测量系统最基本、最重要的特性指标［1］。血竭是《中国药典》2015 年版第一增补本收载品种［2］，具有是活血定痛，化瘀止血，生肌敛疮之功效，用于跌打损伤，心腹瘀痛，外伤出血，疮疡不敛。本文根据《测量不确定度的评定与表示》并参考相关文献［3］，对高效液相色谱（HPLC）法测定血竭含量的不确定度进行分析，找出影响不确定度的因素，对不确定度进行评估，给出扩展不确定度，如实反映测量的可信度和准确性，为评价血竭含量测定结果提供科学依据［4］。

1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（安捷伦1260 infinity Ⅱ）；XS205DU 电子天平（梅特勒）；5 mL、10 mL 容量瓶和1 mL、10 mL 移液管均检定为A 级。

血竭素高氯酸盐对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110811-201707，含量：96.3%）；血竭（广东省医药进出口有限公司，批号：JY20180077）；甲醇，乙腈为色谱纯；磷酸二氢钠为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液（45∶55），流速：1.0 mL/min；检测波长：440 nm；柱温：40 ℃；进样量10 μL，理论塔板数按血竭素峰计算应不低于4 000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取血竭素高氯酸盐对照品约10 mg，置于50 mL 容量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1 mL 于5 mL 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取0.1 g，精密称定，置具塞试管中。精密加入10 mL 3%磷酸甲醇溶液，密塞，振摇3 min，滤过，精密取续滤液1 mL，置5 mL 棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.4 样品测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，记录色谱峰，按外标法以峰面积计算含量。

2.5 测量结果

表1 样品中血竭素的含量

2.6 测量不确定度评定

2.6.1 测量模型本例采用液相色谱外标法测定样品血竭的含量，公式如下：

式中：

X—供试品中血竭的百分含量，%；A样—供试品的峰面积，RA-s；

m对—对照品取样量，g；P对—对照品纯度，%；V对—对照品溶液最终定容体积，mL；

A对—对照品峰面积，RA-s；V样—供试品溶液最终定容体积，mL；m样—样品取样量，g；

考虑样品测量重复性的不确定度后，测量模型为：

式中：

X′—考虑重复性影响后的血竭素的百分含量，%；X—供试品中血竭素的百分含量，%；R—X 的测量重复性，%；

2.6.2 不确定度分量来源分析考虑测量重复性后，不确定度来源用因果图表示，见图1。

图1 血竭含量X′的测量不确定度来源因果图

2.6.3 合成标准不确定度表达式

2.6.3.1 确定u（X′）表达式式（2）为输入量不相关的线性模型，由不确定度传播率得

式中：

u（X′）—合成标准不确定度，%；u（X）—血竭含量X 的标准不确定度，%；

u（R）—X 的测量重复性的标准不确定度，%；2.6.3.2 确定u（X） 表达式 由式（1），根据JJF1135-2005《化学分析测量不确定度评定》，忽略相关性，有：

式中：

urel（X）—X 的相对标准不确定度；urel2（m对）—对照品称样量m 对的相对方差；

urel2（P对）—对照品纯度P 对的相对方差；urel2（V对）—对照品最终定容体积V 对的相对方差；urel2（A样）—样品峰面积A 样的相对方差；urel2（A对）—对照品峰面积A对的相对方差；urel2（V样）—样品最终定容体积V样的相对方差；urel2（m样）—样品称样量m样的相对方差。

2.6.4 测量不确定度分量的量化分析

2.6.4.1 对照品溶液浓度C 对的相对标准不确定度urel（C对） 对照品纯度的相对标准不确定度urel（C对）属于B类测量不确定度。血竭素高氯酸盐对照品来源中国食品药品检定研究院，纯度为96.3%。未给出其不确定度等相关信息，假定其分布区间为±0.05%，按矩形分布计算，相对标准不确定度：

对照品称量的相对标准不确定度urel（m对）有2 个来源，均属于B类测量不确定度。（1）天平示值允差的不确定分析：m对由电子天平采用去皮重法直接测量，m对=0.009 89 g，由于称量船质量为9.604 5 g，此时天平的总载荷则为9.6 g，应取此称样量响应的量程段的最大允许误差计算标准不确定度。查天平检定证书和计量检定规程，使用81 g量程档，量程为5 g～20 g 的允许误差绝对值为0.10 mg，认为服从矩形分布，则：u重复性（m对）=0.10=5.77×10-2mg。（2）天平称量重复性的不确定分析：天平检定证书给出的重复性误差为0.15 mg，认为服从矩形分布，则：u重复性（m对）=0.15=8.66×10-2mg，因称量过程使用减量法，故其不确定度u（m对）==1.47×10-1mg，对照品称样量为9.89 mg，相对标准不确定度urel（m对）=1.47×10-1mg/9.89 mg=1.49×10-2。

对照品溶液稀释的相对标准不确定度urel（V对）有2 个来源，分别为校准和温度，均属于B类测量不确定度。对照品稀释过程使用到50 mL 单标线容量瓶（A 级）、5 mL 单标线容量瓶（A 级）和1 mL单标线吸量管（A 级）。

查JJG196-2006 常用玻璃量具检定规程，50 mL 单标线容量瓶允许误差为±0.05，认为服从矩形分布，则：=2.89×10-2mL，定容时温度为26 ℃，50 mL 单标线容量瓶定标温度为20 ℃，由于液体的体积膨胀明显大于移液器本身的体积膨胀，可只考虑液体的体积膨胀，认为对照品溶液的体积膨胀系数与甲醇相近，甲醇的体积膨胀系数为0.001 18 ℃-1，因此产生的体积增量为50×0.001 18×（26-20）=0.354 mL，因为计算检验结果时不做体积修正，此处将体积变化作为不确定度处理，假设体积变化为矩形分布，则=2.04×10-1mL。由以上两项合成相对不确定度：urel（V对50）=；同理，1 mL 单标线吸量管和5 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度结果见表2；则由对照品储备液稀释过程产生的相对标准不确定度为：

表2 对照品溶液定容体积引入的相对不确定度

2.6.4.2 样品溶液峰面积A 样的相对标准不确定度urel（A供） 查高效液相色谱仪（自编号T0320）检定证书，得高效液相色谱仪测量重复性为0.1%，是相对标准差的形式。因此，可直接得出urel（A样）=0.1%=1.00×10-3。

2.6.4.3 对照品溶液峰面积A 对的相对标准不确定度urel（A对） 与2.6.3.2 的分析相同，可得urel（A对）=0.1%=1.00×10-3。

2.6.4.4 样品溶液最终定容体积V样的相对标准不确定度urel（V样） 样品稀释倍数的不确定度由10 mL单标线吸量管（A 级）、1 mL 单标线吸量管（A 级）、5 mL 单标线容量瓶（A 级）引入，不确定度来源主要考虑容量允许误差和温度影响线性叠加，均属于B类测量不确定度。分析与2.6.3.1.3 相同，结果见表3。则由样品定容体积引起的相对不确定度为：

表3 样品溶液定容体积引入的相对不确定度

2.6.4.5 样品取样量的相对标准不确定度urel（m样）样品称样量m样（约0.1 g）的不确定度由天平引入，天平的不确定度来源主要考虑两项为允许误差和重复性限线性叠加，其标准不确定度分别为u允差（m样）和u重复性（m样）。m 样由电子天平采用去皮重法直接测量，m样≈0.1 g，但由于称量船质量为9.604 5 g，此时天平的总载荷则约为9.7 g，应取此称样量响应的量程段的最大允许误差计算标准不确定度。查天平检定证书和计量检定规程，使用220 g 量程档，量程为0 g～50 g 范围的允许误差绝对值为0.5 mg，重复性允差绝对值为1.0 mg，均认为服从矩形分布，则：

故其不确定度u（m样）=6.45×10-1mg=6.45×10-4g，样品称样量为0.1 g，其相对标准不确定度urel（m样）=0.000 645 g/0.1 g=6.45×10-3。

2.6.4.6 计算合成标准不确定度u（X）含量测定的合成相对标准不确定度为：

则含量测定的合成标准不确定度为：

2.6.4.7 计算测量重复性R 的标准不确定度u（R）测量重复性R 的相对标准不确定度u（R）属于A类不确定度。按正常检验时，制作两份平行样，以平均值作为测得值。为评定重复性标准不确定度，样品平行操作12 份，数据见表1。用贝塞尔公式计算标准差：

正常检验时，血竭含量测得值取两次测量的平均值，故测量血竭含量的重复性标准不确定度为：u

2.6.5 计算合成标准不确定度数值u（X′）

2.7 评定扩展不确定度

取包含因子k=2，扩展不确定度为：U=u（X′）×2=0.033 4%×2=0.07%

2.8 报告测量结果

本次测量中药材血竭含量为：（1.29±0.07）%，第二项为扩展不确定度U 的值，k=2。

表4 不确定度一览表

（续表）

3 讨论

本文通过对HPLC 法测定血竭含量的测量不确定度评定，分析了各测量不确定度分量。根据分析结果，影响测定的不确定度来源有对照品自身与其配制过程、仪器的测量性能、样品处理过程与方法测量重复性等。其中，对照品的称样量和样品测量重复性引起的不确定度比较大，其次是对照品和样品的稀释体积。因此在实际操作过程中，操作人员可适当增加对照品的称样量，选用精度符合检验要求并经计量校正合格的电子天平，定期进行仪器维护保养以提高仪器的灵敏度，使用经过计量校正合格的容量仪器进行稀释定容，增加平行样品的测定，提高操作人员操作水平，进一步降低样品测定重复性引入的不确定度，从而提高测量结果的准确度。