血栓形成中的凝血与免疫

张薇，阎涛

凝血和免疫是联系广泛、高度整合、微妙平衡的生物系统，防御病原体对机体的伤害和入侵，任何成分的失调都会影响整个系统平衡，导致不同程度炎症和血栓形成，缺血性卒中也是其中之一[1]。2011年Guido Stoll等[2]提出缺血性卒中中“血栓-炎症”的理念，卒中急性期“血栓-炎症”级联反应会导致缺血的进展，其病理生理机制为血液级联系统（补体、接触、凝血、纤溶系统及血小板）、免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞）和血管内皮细胞之间相互作用[3]。促进血栓形成的机制和反应是复杂多样的，由于各种放大机制及不同系统之间的相互作用，任何级联系统的触发都可以迅速导致全面的血栓形成和炎症的发生。本文简要综述凝血与炎症之间的分子和细胞关系及其在血栓形成中的作用，以期为血栓性疾病的研究策略提供参考。

1 血小板及凝血相关因子

1.1 血小板 在内皮受损后血小板黏附在暴露的血管损伤内皮上，暴露的胶原直接与血小板糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰa/Ⅱa和GPⅥ受体结合诱导血小板活化，促进激活的细胞释放介质，如ADP、5-羟色胺和凝血酶，进一步通过信号传导途径激活血小板形状的改变和整合素的表达，促进血小板的粘连[4]。除了止血和血栓形成以外，血小板还参与先天免疫反应的病理生理过程，活化的血小板上P-选择素与内皮细胞、白细胞表达的P-选择素糖蛋白配体-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）结合，调节中性粒细胞募集和激活，从而介导先天免疫反应[5]。此外血小板通过其膜上的Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）检测病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），释放杀菌产物并诱导中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）的释放[6]。NET由DNA、组蛋白和其他细胞核及细胞质成分（包括弹性蛋白酶、乳铁蛋白、髓过氧化物酶和钙保护素）形成的中性粒细胞网状释放物组成，可以直接激活内源性凝血途径的凝血因子Ⅻ及组织因子（tissue factor，TF），以启动凝血级联反应[7]。NET中存在的特异组蛋白H3和H4，不仅表现为损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）激活补体途径，而且结合血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）诱捕血小板导致其聚集形成血栓[8]。急性心肌梗死患者的血栓中含有大量中性粒细胞和高水平的NET，是血栓的重要组成部分，提示NET在动脉血栓形成中具有重要作用[9]。同样，在缺血性卒中患者血栓成分中，发现活化的中性粒细胞和瓜氨酸化组蛋白H3[10]。此外，中性粒细胞来源的丝氨酸蛋白酶和细胞外核小体也可以诱导血栓形成，通过TF途径抑制物的局部蛋白水解来加强凝血[11]。因此，血小板作为免疫效应细胞，既能通过TLR识别病原体，又能与先天免疫细胞进行信号传递以增强其血栓前过程。

血小板活化产生的微粒（micro vesicle，MV）是循环中MV的主要来源，富含核酸、蛋白质、脂质和小分子，在血小板与内皮细胞和先天免疫细胞的联系中起着重要的作用[12]。研究表明，携带有microRNA的MV可以调节巨噬细胞中不同mRNA的转录，将巨噬细胞编程为吞噬表型[13]；来自血小板和其他细胞的MV可促进单核细胞和中性粒细胞与内皮细胞的黏附，激活TF促进血栓形成[14-15]。以上研究结果表明MV在凝血-炎症-血栓病理生理过程中发挥重要调节作用，以MV为工具运输microRNA或纳米药物等策略可能是将来血栓性疾病治疗的潜在方向。

1.2 凝血相关因子 凝血相关因子是参与凝血过程的生物分子，在凝血过程被相继激活转为有活性的蛋白酶，TF和凝血酶在凝血过程中发挥关键靶点作用，当血管受损时，TF与受体凝血因子Ⅶa结合催化凝血因子X和凝血因子Ⅸ的蛋白水解，导致下游产物凝血酶的生成，进而导致纤维蛋白和血栓形成。除了促凝事件外，凝血相关因子尚能过通特定受体介导血管系统炎症级联反应的信号传递发挥其促炎效应。

1.2.1 组织因子 TF是外源性凝血级联反应的主要启动因子。MV和单核细胞是循环中TF的重要来源[16]，在血小板激活因子（plateletactivating factor，PAF）或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的刺激下，TF移位到细胞表面，并且血小板的激活可以诱导TF mRNA的成熟、蛋白质翻译和表面易位，触发凝血酶生成和血栓形成[17-18]。在心肌梗死动脉粥样硬化斑块破裂后形成的血栓中TF表达升高，单核/巨噬细胞及其MV来源的TF活性也升高，表明TF可导致斑块破裂后的血栓形成[19]。此外，非编码的microRNA在血管系统转录后基因表达的调控中发挥重要作用，有研究发现通过上调动脉粥样硬化性疾病患者miR-223表达的治疗干预，可以通过抑制内皮细胞TF的表达来减少动脉粥样硬化血栓形成事件[20]。Ⅶa与其天然受体TF结合形成TF/Ⅶa复合物，通过蛋白酶活化受体2（protease-activated receptor-2，PAR-2）途径激活P44/42丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）、Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）等促炎信号引起IL-6和其他趋化因子等炎性因子的分泌，促进动脉粥样硬化斑块形成和发展[21]。因此，TF在动脉粥样硬化导致血栓形成的起始和发展中起到关键作用。

1.2.2 凝血酶 丝氨酸蛋白酶凝血酶是凝血途径中的关键蛋白，通过促凝促炎效应发挥其止血和血栓作用。凝血酶裂解纤维蛋白原产生纤维蛋白，激活蛋白酶激活受体（proteaseactivated receptor，PAR）的G蛋白偶联受体家族介导对细胞的直接作用[22]。PAR在血小板、内皮细胞、免疫细胞、上皮细胞、星形胶质细胞和神经元等细胞中表达。凝血酶切割PAR-1、PAR-3和PAR-4活化血小板，动员细胞内钙，将黏附分子P-选择素和CD40配体及与凝血酶原结合的磷脂酰丝氨酸转移到血小板表面[23-24]，释放凝血因子Ⅴ、纤维蛋白原和凝血因子ⅩⅢ ，进一步增强凝血酶的生成和血凝块的稳定性导致血栓形成。

在炎症方面，凝血酶激活内皮细胞PAR-1，通过核因子-κB（nuclear factor kappalightchain-enhancer of activated B cell，NFκB）介导抑制蛋白I-κB的磷酸化和降解，导致NF-κB易位到细胞核并刺激各种促炎基因的转录。这种信号级联反应启动多种促炎介质的产生，包括IL-6、IL-8、转化生长因子-β、单核细胞趋化蛋白-1、血小板源性生长因子、细胞间黏附分子-1和P-选择素[25-26]。进一步介导血小板和白细胞在内皮上的募集、黏附和滚动，通过PAR诱导IL-6及成纤维细胞和单核细胞产生IL-8表达上调，增大血小板活化效应，这些过程形成正反馈回路放大血管表面的炎症和促凝过程[27]。

2 接触激活系统

接触激活系统由4种血浆蛋白组成：凝血因子Ⅺ、凝血因子Ⅻ、前激肽释放酶（prekallikrein，PK）和高分子量激肽原（high molecular weight kininogen，HK）。接触蛋白以循环中的非活性形式接触带负电荷的无机多聚磷酸盐（polyphosphate，polyP）发生激活，分别通过内源性凝血途径和激肽释放酶-激肽系统启动促凝和促炎反应[28]。凝血因子Ⅻ与带负电荷的polyP结合发生活化，将PK切割成激肽释放酶（kallikrein，KAL），进一步激活凝血因子Ⅺ启动凝血酶和纤维蛋白的形成。血浆激肽释放酶将HK裂解为BK，与G蛋白偶联激肽B2和B1受体结合启动磷脂酶C、NF-κB等信号通路导致中性粒细胞分泌细胞因子如IL-6、IL-8或TNF-α介导炎症反应[28-29]；此外BK还可以IL和TNF依赖的方式激活B1受体以响应组织损伤和炎症调节免疫反应，激活B2受体和TLR导致树突状细胞的反应[30]。除了凝血因子Ⅻ外，PK和HK也都可导致卒中后小鼠微血管血栓形成、血脑屏障渗漏、水肿形成和炎症。与野生型小鼠相比，PK和HK基因敲除小鼠的脑内巨噬细胞/小胶质细胞和中性粒细胞显著减少，脑梗死体积减小，脑水肿减轻且脑内免疫细胞浸润较轻[31-32]。

3 补体系统

补体是免疫系统的重要组成部分，通过经典途径、凝集素和替代途径被激活，最终会聚成中心蛋白酶C3转化酶。C3转化酶进一步作用于下游因子产生过敏性毒素C3a和C5a及膜攻击复合体C5b-9，在感染的细胞膜内创建跨膜通道，导致细胞溶解和死亡，构成炎症的重要组成部分。C3a和C5a分别与G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）相结合而介导多种炎症和血栓前过程。C3a和C5a诱导内皮细胞表达IL-6、IL-8、IL-1、单核细胞趋化蛋白-1和T细胞激活性低分泌因子，促进单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的募集和激活，引起内皮通透性升高[33]。补体通过C5a介导中性粒细胞和内皮细胞上的TF表达、激活的内皮细胞和血小板上P-选择素的暴露增加及内皮细胞分泌vWF因子介导血栓前过程[34]。补体激活的凝集素途径的重要组成部分是甘露糖相关丝氨酸蛋白酶（mannose-binding lectinassociated serine protease，MASP）-1和MASP-2，MASP-1可切割凝血因子ⅩⅢ 、HK、纤维蛋白原和激活凝血酶激活的纤溶抑制物[35]，MASP-2可将凝血酶原切割为凝血酶，裂解C4产生C3转化酶，它们在补体激活和凝血中发挥重要作用[36]。此外，血小板活化后在血凝块形成过程中形成纤维蛋白，可导致MASP-1和MASP-2的激活[34]，进一步放大血栓性疾病中的凝血和炎症反应。

4 纤溶酶原激活系统

纤溶酶原激活系统由一组蛋白酶和蛋白酶抑制剂组成，在血块溶解的同时也可以促进与血栓形成有关的炎症过程，通过降解纤维蛋白和启动促进伤口愈合和血管生成的免疫过程来驱动纤溶。在止血或血栓形成过程中凝血酶激活内皮细胞表达和分泌tPA和尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase-type plasminogen activator，uPA）：tPA通过诱导中性粒细胞脱颗粒导致MMP-9、MMP-8、弹性蛋白酶和髓过氧化物酶的释放[37]，促进中性粒细胞的迁移；uPA通过中性粒细胞激活介导激活JNK途径和NF-κB核转位增加促炎细胞因子IL-1、人巨噬细胞炎症蛋白2和TNF的表达[38]。此外tPA和uPA水解纤溶酶原产生纤溶酶切割纤维蛋白，增强tPA、纤溶酶原和纤维蛋白之间的相互作用，进一步促进纤维蛋白凝块上的纤溶酶生成，导致纤溶增强、细胞外基质重塑、MMP激活和诱导NF-κB信号通路驱动炎症反应[39]。纤溶酶还可以直接激活C3和C5[40]，产生炎性过敏毒素C3a、C5a和C5b，启动膜攻击复合物免疫反应介导炎症过程。

综上所述，血小板、TF、凝血酶、接触激活系统、补体系统和纤溶系统等在凝血和血栓形成发展中扮演重要角色，同时通过多种机制介导凝血后炎性反应，二者相互依存，相互影响。对炎症和凝血之间分子机制的更深入了解，将有助于研究者更有效地识别血栓性疾病新的治疗靶点，同时调节凝血和炎症的治疗策略可能有潜在的价值。

【点睛】凝血和免疫在血栓的形成中密切相关，本文综述了凝血-免疫在血栓形成中的相互作用，为抗栓治疗策略的研究提供参考。