基因检测结核分枝杆菌异烟肼、利福平耐药与液体培养法对比的临床价值

李俊，刘君君，张宇，熊峰，赵建，刘锦宏

（荆州市胸科医院，湖北 荆州 434000）

0 引言

结核病是比较常见的一种疾病，近年来，因为治疗不规范或药物滥用的影响，耐多药结核病（multidrug resistance tuberculosis，MDR-TB）在我国的发病率呈现出明显的上升趋势，其患者数量居于世界首位，并且也是全球22 个耐多药高负担的国家之一[1]。在结核病的临床治疗中，利福平和异烟肼是比较常见的药物，也是诊断耐多药结核病的一个有效依据，通过检测其耐药性，不仅可以及时诊断耐多药患者，还可以为制定针对性治疗方案提供有效依据[2]。溶解曲线法是近几年新发展的结核耐药检测方法，以该方法为基础研发的异烟肼、利福平耐药突变检测试剂盒于2013 年1 月获颁国家食品药品（SFDA）监督管理局医疗器械注册证书。因此，本文对结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药诊断中运用基因检测的临床价值进行了探讨，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018 年2 月至2019 年7 月我院收治的结核病患者脓液、灌洗液、脑脊液、胸腹腔积液以及痰液经培养证实为结核分支杆菌的180 例阳性标本为研究对象，其中女75 例、男105 例，年龄25-72 岁，平均（48.6±12.5）岁。

1.2 方法

（1）药敏实验。稀释菌液：运用22SWG 标准接种环取2 满环1mg/mL 的静置好的结核菌菌液放入灭菌生理盐水2mL 中，先稀释为10-2mg/mL 的菌液，然后再用同样的方法进行100 倍稀释，即10-4mg/mL 菌液。接种：运用22SWG 标准接种环取1 满环在对照及已经配制好的含药培养基斜面上均匀接种，使最终菌液接种浓度为10-6mg/mL 和10-4mg/mL，若培养菌落数＞50 个，则可判断为耐药。同时，样本接种：①在药敏试管架上放入MGIT试管；②将0.8mL S.I.R.E Supplement 加入MGTT 试管；③在相应的MGIT 试管中分别加入S.I.R.E 药物100μL；④对生长对照菌液进行准备，即在无菌生理盐水10mL 中放入100μL 菌液，作1:100 稀释，均匀混合；⑤取稀释后的菌液0.5mL 放入生长对照管，均匀混合；⑥将0.5mL未稀释的菌液分别加入药敏管中，均匀混合；⑦上机培养6-12d 后，仪器自动报告药敏结果。

（2）荧光PCR 溶解曲线法检测异烟肼和利福平耐药。运用标准接种环对固体进行收集，离心用250μL 的TB DNA 提取液重悬后放入99℃中进行2min 加热，离心后在配制好的含有20μL PCR 反应液的反应管中加入5μL 上清液，并且运用Lightcycler 480 PCR 仪中进行扩增和溶解曲线分析。判定结果：若样品的Tm 值低于阳性对照2℃或以上则为突变型；若样品的Tm 值与阳性对照的Tm值基本一致则为野生型。

1.3 测序分析

对传统药敏法和基因检测荧光PCR 溶解曲线法不一致的样本进行测序分析。同时，运用传统法为金标准来对荧光PCR 溶解曲线法的特异度和灵敏度进行计算，并且对两种方法的符合率进行评价。

1.4 统计学分析

由SPSS 20.0 软件分析数据，组间计数资料比较行χ2检验，并且以P＜0.05 表示有差异。

2 结果

2.1 两种方法符合率

两种方法检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼的耐药性符合率比较无差异（P＞0.05），见表1。

表1 两种方法符合率对比[n（%）]

2.2 溶解曲线法检测利福平和异烟肼的各项指标比较

溶解曲线法检测异烟肼的特异度以及灵敏度分别为93.9%、85.4%；而利福平则为97.1%、92.3%，见表2。

表2 溶解曲线法检测异烟肼和利福平的各项指标对比

3 讨论

近年来，随着耐药结核病患者人数的增加，在结核病患者的临床治疗中，耐药问题已经成为当前迫切需要解决的一个问题，所以选择一种合适的方法检测结核病的耐药性有着极其重要的意义[3]。《2016 年耐药结核指南》是WHO 对近年来耐药结核病治疗及分子生物学、外科诊治等方面研究成果的总结[4-6]。快速诊断技术进行测试的方法和更短、疗效更好的耐多药结核病治疗方案给我们带来了新的希望[7-9]。在结核分枝杆菌异烟肼、利福平的耐药检测中，传统的液体培养法是比较常用的一种方法，但是需要较长的周期，并且操作比较复杂，在一定程度上限制了临床应用。而基因芯片技术作为一种分子生物学技术，将生物芯片的高通量性和分子生物学的高灵敏度相结合，具有准确、灵敏以及快速的优点，可以被广泛运用在结核菌耐药性检测中[10-13]。综上所述，临床上在检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平的耐药中，相比较液体培养法而言，基因检测法具有快速、准确率高的优点，可以作为有效的一种方法，具有一定的推广应用价值。