反刍动物瘤胃微生物区系研究进展

杨 艳，瞿明仁，欧阳克蕙，娄佑武，甘兴华，饶 辉，王荣民，顾 瑶，江 航

(1.江西省畜牧技术推广站，江西 南昌 330046；2.江西农业大学 动物科技学院，江西 南昌 330045)

瘤胃微生物对反刍动物生产具有重要的影响。它能使反刍动物能够利用发酵植物性蛋白、多糖以及纤维素等，以产生动物机体维持生长所必需的能量与养分[1,2]；另一方面，在瘤胃中进行的大量复杂的代谢过程中产生的各种代谢物也被微生物用于自身的增殖[3]。因此，开展对瘤胃微生物的研究，对指导生产实践具有重要意义。

1 瘤胃微生物区系的组成

1.1 瘤胃细菌

细菌是瘤胃微生物中含量最为丰富、多样，代谢最为活跃的一类。瘤胃细菌根据功能大体可以划分为成纤维降解菌、半纤维降解菌、淀粉降解菌、糖类分解菌、利用酸菌、蛋白分解菌、产甲烷菌、脂肪分解菌等。瘤胃细菌革兰氏阴性菌占大多数，但是革兰氏阳性菌在高能量日粮饲喂条件下有增加的趋势。瘤胃内的纤维降解菌的数量最大，主要包括了瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌、产琥珀酸丝状杆菌、梭菌等。研究者们通过电子显微镜[4]以及定量 PCR技术[5]发现瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)作为瘤胃内主要的纤维降解菌在纤维的降解过程中最为重要，分泌的纤维素酶活性最高[6]。在饲喂高比例淀粉含量的日粮时，瘤胃淀粉降解菌的比例将增加。淀粉降解菌主要包括牛链球菌、嗜淀粉瘤胃杆菌、栖瘤胃普雷沃氏菌及反刍兽新月型单胞菌。瘤胃内功能细菌大多数具有特定的蛋白酶活性，瘤胃嗜淀粉菌是目前已知的活性最高的瘤胃蛋白分解菌；具有较高的蛋白质降解活性的还有栖普雷沃氏菌(Prevotella)、反刍兽新月型单胞菌(Selenomonasruminantium)、牛链球菌(Streptococcusbovis)。乳酸利用细菌包括新月形单胞菌(Selenomonas)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)以及向碱性韦荣氏球菌(Veillonella)。目前研究认为瘤胃细菌中产乳酸较多的是乳酸杆菌(Lactobacillus)和牛链球菌。

瘤胃微生物主要存在于瘤胃液、瘤胃内容物及瘤胃上皮上附着。瘤胃液内的细菌又称液相细菌，属严格厌氧细菌，最易获得且研究较多。瘤胃内容物细菌是指定植附着于固态饲料颗粒上面的细菌，又称固相细菌，其通过附着固相底物而分泌产生酶并将附着的底物消化降解从而获取养分。固相细菌中包含着大量能分解利用纤维的纤维降解菌，产生较液相细菌数量更多的多糖酶，并且总酶活是液相的100倍之多[7]，所以瘤胃固相细菌是降解纤维素的最重要的组成成分。在研究荷斯坦奶牛瘤胃液相与固相中的细菌菌群结构中发现，液、固相细菌结构差异相差较大，其中低鸟嘌呤和胞嘧啶含量的革兰氏阳性菌在瘤胃液相中的比例为52.4%，在瘤胃固相中的比例为71.4%[8]。

1.2 瘤胃原虫和真菌

瘤胃内原虫的含量低于细菌，其个体较大，纤毛虫是原虫中个体最大、数量最多的。徐淮白山羊瘤胃中原虫密度为2.26×105个/mL，占瘤胃微生物量的44.83%[9]。瘤胃内原虫会吞食淀粉、脂肪，从而保障瘤胃pH值稳定在固定的范围内，对维持微生物生态系统的平衡起到一定积极的作用[10]；并会分泌纤维水解酶，降解植物细胞壁[10]，使得瘤胃干物质降解率[11]、蛋白质降解率、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维的降解率[12]得到大幅度提高。目前发现的瘤胃真菌划分为6个菌属18种，分为Anaeromyces、Orpinmyces和Cyllamyces的多中心菌体，Neocallimastix、Piromyces和Caecomyces的单中心菌体。前人从饲喂青干草的山羊瘤胃液中分离到四类厌氧真菌，分属于Orpinomyces、Anaeromyces、Piromyces和Neocallimastic[13]。反刍动物瘤胃内降解日粮中木质纤维素最有效的一类微生物类群是瘤胃内的厌氧真菌[14]。

2 影响瘤胃微生物区系结构的因素

2.1 宿主

宿主是影响反刍动物瘤胃微生物区系结构的最重要的因素之一。宿主不同，其瘤胃内的微生物种类、数量均不相同。比较分析鲁西肉牛、荷斯坦奶牛、晋南牛、黄牛、牦牛以及Hanwoo的9个16SrDNA文库组成及序列多样性发现：鲁西肉牛瘤胃细菌文库中的91%克隆来自未培养细菌，拟杆菌和梭菌为优势菌群；采食不同日粮的荷斯坦奶牛个体间的16SrDNA文库组成差异不明显，但与亚洲品种如黄牛、鲁西牛的16SrDNA文库组成的差异较显著[15]。对比沼泽型水牛、大额牛瘤胃中、荷斯坦牛的16sRNA基因序列后发现，溶纤维丁酸弧菌仅在大额牛和水牛中发现，双孢梭菌、硫氧化细菌、略紫色梭菌等细菌仅在水牛中发现，生黄瘤胃球菌仅存在于水牛与荷斯坦牛中，3个品种均有瘤胃解琥珀酸菌和瘤胃假丁酸弧菌[16]。在相同日粮饲养条件下，水牛的黄色瘤胃球菌和厌氧真菌数量低于印度家牛，纤维素降解菌数量高于印度家牛[17]。云南大额牛对高纤维粗料的消化能力明显高于本地黄牛，其主要原因是云南大额牛瘤胃中纤维素降解菌比本地黄牛多，并且含有大量的毛螺菌等[18]。研究比较荷斯坦奶牛、波尔山羊、梅花鹿的细菌菌群结构时发现：荷斯坦奶牛的优势菌为Pseudobutyrivibrioruminis(假丁酸弧菌)、Eubacteriumruminantium(反刍真杆菌)；波尔山羊的优势菌为Clostridium(梭菌属)；梅花鹿的优势菌为Prevotella(普雷沃氏菌属)、Succinivibriodextrinosolvens(溶糊精琥珀酸弧菌)[19]。当饲喂同一日粮时，绵羊瘤胃内的原虫数量显著低于山羊[20]。山羊家畜亚科(Caprahircus)和阿尔卑斯野山羊(Caprapyrenaicahispanica)两个品种的瘤胃原虫多样性研究结果表明，原虫多样性在两个山羊种属内的差异小于种属间的差异[21]。

2.2 生理阶段

反刍动物从出生到2岁期间瘤胃微生物区系有较大变化。瘤胃为厌氧环境，其中的细菌是厌氧菌。但在幼龄时，瘤胃的微生物不完全是厌氧的。通过体外培养发现，反刍动物在幼龄阶段，其瘤胃微生物区系含有兼性厌氧菌与需氧菌；但随着日龄的增长，瘤胃发酵功能的日趋成熟，厌氧菌完全替代了这类菌群[22-24]。在成年的反刍动物瘤胃微生物中，细菌结构组成从门水平上分析，主要包括厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门[25,26]。成熟反刍动物瘤胃微生物区系结构较稳定，而幼龄期瘤胃微生物区系随着出生后时间的延长会有数量和种类上的明显变化。8～10月龄犊牛瘤胃微生物区系检测到2095个细菌的操作分类单元(OTU)，分属于24个细菌门类，其中57.2%的OTU属拟杆菌门，26.8%的OTU属厚壁菌门[27]。但7～63日龄的犊牛瘤胃微生物区系中细菌的OTU只有1588个，能检测到的只有 23 个细菌门类[28]。具体到细菌种类上，对初生犊牛的瘤胃微生物区系使用实时荧光PCR技术研究发现，变形菌门在出生后第1～3天时占比极高，甚至超过厚壁菌门和拟杆菌门，但是随着时间的推移，变形菌门所占比例也在逐渐减少[23]。在研究瘤胃细菌种群结构中发现，拟杆菌门在动物出生第3天时成为了占比例最高的菌门，在83日龄前最高时甚至可以占到 62.1%[29]。上述研究证实了瘤胃微生物区系在一定程度上也受年龄(日龄)因素的影响。

2.3 日粮

前人针对不同品种及饲喂日粮类型对瘤胃微生物菌群变化的影响做了相关研究，发现日粮因素对瘤胃菌群的影响比品种因素方面要更为显著[30-31]。在对饲喂不同精粗比日粮的8～10月龄的荷斯坦奶牛开展的瘤胃微生物区系研究结果表明，拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门的丰度较高，平均丰度分别为57.2%、26.8%和10.3%左右，并且随着精料水平的提高，Fibrobacteres的丰度逐渐下降。利用16SrRNA测序技术测定高牧草组和高精料组的牦牛细菌菌群结构，发现高牧草组的BacteroidalesBS11，PrevotellaceaeUCG-003，RuminococcaceaeUCG-011，BacteroidalesRF16和RuminococcaceaeUCG-010的丰度高于高精料组，而BacteroidalesS24-7、RuminococcaceaeNK4A214、Succiniclasticum以及Ruminococcus2的相对比例低于高精料组[32]。日粮类型对瘤胃真菌Neocallimastigalesassemblages有较大的影响[33]。同时，一些研究也指出在日粮中添加大蒜油[34]、豆油胡、麻油[35]等植物油以及莫能霉素、维吉尼亚霉素等抗生素[36]、益生菌酵母等微生态制剂[37]以及硫胺素等维生素[38]均能在一定程度上影响瘤胃细菌菌群结构，从而达到调控瘤胃发酵模式的目的。同时，也有研究指出在日粮中添加烟酸后提高了瘤胃的原虫数量和密度，促进了原虫生长[11,39]，特别是提高了纤毛虫的数量[11]。

2.4 定植部位

研究发现羊瘤胃内微生物在液相与固相中的分布存在明显的差异[40]。在饲用全价混合日粮的奶牛瘤胃中，液相的栖瘤胃普氏菌(Prevotellaruminicola)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、牛链球菌(Streptococcusbovis)的比例较高，而在固相中白色瘤胃球菌(Rumincoccusalbus)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)、反刍真杆菌(Eubacteriumruminantium)的比例较高[41]。在肉牛瘤胃微生物研究中发现，饲用粗饲料日粮为主的肉牛瘤胃解琥珀酸弧菌(Succiniclasticum)和Paludibacter在液相的比例比固相中的高，而普氏菌属和螺旋体属在固相的比例比液相高，分布在瘤胃固相内容物上的分解纤维类的微生物比例要比液相的高。反刍动物在饲喂粗饲料和混合粗饲料的瘤胃上皮微生物区系的相似性较高，而饲喂高比例精料日粮的瘤胃上皮微生物区系的相似性较低[42]。在瘤胃上皮细菌中厚壁菌门为优势菌，且上皮微生物区系结构比固相、液相微生物的结构更加稳定[43]。

3 瘤胃微生物菌群研究方法进展

瘤胃微生物群落是最复杂的生物体系之一，有着丰富的基因资源和生态资源。传统的瘤胃微生物研究的前提是必须通过体外培养获得目的菌株，才能对其性质等进行描述研究。但瘤胃微生物的自然生长环境复杂并且严格厌氧，导致瘤胃细菌不到20%的种类可以体外培养[43]，而80%以上的种类无法开展研究，且体外培养不能完全模拟瘤胃微生物所处的瘤胃微生物共生的真实环境，所以传统的研究方法的局限性限制了人们对瘤胃微生物的生态功能研究。直到20世纪80年代后，人们开始利用分子生物学技术通过瘤胃微生物的遗传物质DNA对其功能及多样性方面进行了研究[44,45]。利用分子生物学技术，可以直接对微生物的DNA或者RNA序列进行分析，从而极大地促进了对瘤胃内未培养微生物的研究。1993年Krumholz等利用分析核糖体RNA小亚基基因序列，将体外培养从未获得的瘤胃细菌卵状奎因氏菌成功地做了分类确定[46]。早期采用分子生物学技术开展瘤胃微生物研究的方法主要有单链构象多态性(SSCP)、限制性片段长度多态性(T-RFLP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、荧光原位杂交(FISH)、Real-time PCR等。这些技术方法虽反映出了瘤胃微生物菌群结构组成的信息，但由于存在分辨识别度不高等缺点，所以也不能全面反映出瘤胃微生物多样性，通过此类方法获得的微生物信息量明显少于实际情况[47]。随着分子生物学的进步，1998年由Handelsman等提出的宏基因组学近年来在研究瘤胃微生物方面表现出明显的优势。它可以绕过培养未能培养的微生物这一技术局限，并且能研究特定环境中可培养的和未培养的全部微生物信息的总和[48]。早期的宏基因组学主要是直接提取特定环境中的总DNA，克隆到可培养的宿主细胞，通过重组克隆子的序列和功能分析挖掘出那些未能培养的微生物信息。Daniel等[49]和Ufarte等[50]对文库构建方法和功能筛选作了详细介绍。研究者们已经将宏基因组学的技术成功应用到瘤胃、土壤等特定环境中的纤维素酶[51]和脂酶[52]的研究中。随着二代测序技术的兴起，扩增子以及全基因组测序是宏基因组学的两个主要的研究方向。扩增子测序技术主要用于开展特定环境下微生物群落区系的结构和丰度等信息的研究，全基因组测序则主要用于开展微生物群落功能的研究。应用Roche454 FLX或Illumina MiSeq等测序平台对微生物宏基因组的16S/18S小亚基rRNA或DNA序列进行测序，将读出的序列除杂优化后，用Mothur或QIIME生成可操作分类单元OTU，从各OTU中挑选1条代表性序列与微生物数据库(SILVA、Greengenes、RDP)进行比对分析，可以得到该特定环境中的物种分类及丰度信息[53]。2014年Roggenbuck等采用Roche454 FLX测序发现长颈鹿瘤胃微生物中有20%的细菌序列为首次发现，且瘤胃固液相优势菌均为Firmicute、Bacteridetes菌门[54]。研究者们采用扩增子测序技术对牛的瘤胃微生物多样性的研究还发现个体对细菌的多样性有较大影响，并指出不同的个体中仅51%的细菌分类是相似的[55]。

扩增子测序技术主要用于研究微生物群落结构，而无法满足微生物功能研究的要求。但近年来基于扩增子测序的PICRUSt功能预测分析开始发展起来，与宏基因组研究相比，PICRUSt功能预测分析研究成本更低，同时预测的效果可靠性较高，因而开始被研究者们关注并采用[56]。目前该方法已在土壤细菌功能研究中得到应用，为细菌功能研究提供了更多可靠信息[57-59]。