决明子醇提物对胰岛β细胞凋亡的影响及其机制

白 兰，李思奇，张翼麒，张雪妍，肖镜怡，张 杰

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

决明子(Semen Cassiae)为植物决明的成熟干燥种子，又名草决明、马蹄决明，属双子叶植物纲，决明属。决明子中含有吡咯酮、萘骈、蒽醌等多种成分，具有清肝明目，降压降脂利尿，抗衰老，增强免疫力等作用[1-4]。2型糖尿病是一种复杂的糖、脂代谢紊乱的疾病，胰岛β细胞的损伤在其病程的发生发展中起到重要的作用，而高脂毒性可进一步损伤胰岛β细胞，本课题主要研究决明子醇提物(Ethanol extraction from Semen Cassiae，ESC)对高脂培养的胰岛β细胞的保护作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料小鼠βTc3细胞株(北京欣源佳和生物科技公司);MTT(Sigma公司)；Trizol(Invitogen公司)；1640培养基(美国Thermo公司)；Hoechst33258染色液(碧云天生物技术公司)；核苷酸引物(上海生工生物技术有限公司)；决明子(牡丹江保健大药房)。

1.2 ESC的制备决明子100 g研磨成粗粉，80%乙醇水溶液(料液比1:15)，超声60 ℃ 30 min提取3次，合并提取液，干燥合并液，得到15.92 g浸膏。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 从培养于RPMI-1640培养液的βTc3细胞中，取同代细胞分为4组。正常对照组：RPMI-1640完全培养基；模型组：0.75 mmol/L棕榈酸的1640完全培养基；低剂量ESC组：含15 mg/L ESC和0.75 mmol/L棕榈酸的1640完全培养基；高剂量ESC组：含30 mg/L ESC 和0.75 mmol/L棕榈酸的1640完全培养基。各组βTc3细胞继续在含药物的培养基中培养24 h。

1.3.2 MTT试验 各组βTc3细胞按上述方法培养细胞24 h。各组分别加入20 μL MTT(5 g/L)，继续孵育4 h，弃去上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，酶标仪调至波长490 nm处，各孔测定吸光度值(OD)，用调零组(RPMI-1640培养液)进行调零，代入公式计算ESC对细胞生长抑制率(inhibition rate，IR)的影响。IR=(OD对照组- OD实验组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

1.3.3 荧光显微镜检测βTc3细胞凋亡 0.25%胰蛋白酶消化不同组的βTc3细胞，磷酸盐缓冲液(PH7.2)洗涤4遍，固定液4 ℃固定12 min，用蒸馏水洗涤4遍。在CO2培养箱中37 ℃，加入Hoechst 33258染色液，孵育βTc3细胞15 min，盖上盖玻片，避光，荧光显微镜观察Hoechst 33258染色的细胞。凋亡细胞呈现绿色深染的荧光标记。计数凋亡细胞，代入公式计算ESC对βTc3凋亡率(apoptosis rate,AR)的影响。AR ={凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)}×100%。

1.3.4 RT-PCR方法检测bcl-2、caspase-3表达水平 Trizol法提取各组细胞总RNA进行反转录， bcl-2上游引物序列：5′-GACTTCTCGTCGCTACCGTC-3′；Bcl-2下游引物序列：5′-TGCACCTACCCAGCCTCCCTTATC-3′，扩增产物296 bp。caspase-3上游引物序列：5′-AGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3′；下游引物序列：5′- CGGGATCTGTTTCTTTGCAT-3′，扩增产物342 bp。β-actin上游引物序列：5′-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3′，β-actin下游引物序列：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′，扩增产物838 bp。反应参数：95 ℃预变性2 min，94 ℃ 40 s，53 ℃42 s，65 ℃延伸1 min，40个循环，71 ℃ 10 min复性。每组重复试验3次，计算Bcl-2、caspase-3相对表达量。

1.4 统计分析应用SPSS 17.0软件包进行分析，各组数据以“均数±标准差”表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESC对βTc3细胞生长抑制率的影响与模型组相比较，低剂量ESC组和高剂量ESC组均能减轻高脂毒性对胰岛βTc3细胞抑制生长的作用(P<0.01)，见表1。

表1 ESC对βTc3细胞生长抑制率的影响

2.2 ESC对βTc3细胞凋亡率的影响与模型组细胞凋亡率相比较，低剂量ESC组和高剂量ESC组均能降低高脂毒性导致的胰岛βTc3细胞凋亡(P<0.01)，见表2、图1、图2。

表2 ESC对βTc3细胞凋亡率的影响

图1 模型组(×400)

图2 高剂量ESC组(×400)

2.3 ESC对βTc3细胞bcl-2、caspase-3基因表达的影响与模型组比较，低剂量ESC组和高剂量ESC组bcl-2基因mRNA的表达明显增高；与模型组比较，低剂量ESC组和高剂量ESC组caspase-3基因mRNA的表达明显降低，见表3、图3、图4。

表3 ESC对βTc3细胞bcl-2、caspase-3 mRNA表达的影响

图3 ESC对βTc3细胞bcl-2 mRNA表达的影响

图4 ESC对βTc3细胞caspase-3mRNA表达的影响

3 讨论

2型糖尿病是一种复杂的全身性代谢疾病，其发病机制主要研究胰岛素抵抗、胰岛素分泌不足等方面，但持续高血脂引起的胰岛β细胞功能减退在糖尿病的发生发展中也有重要作用[5-6]。而细胞凋亡是胰岛β细胞损伤的主要方式之一[7-8]，成为2型糖尿病发病机制研究的新的靶点。本实验用0.75 mmol/L棕榈酸体外诱导β细胞凋亡，结果显示，模型组胰岛细胞β细胞凋亡率显著增加，进一步验证脂毒性对胰岛β细胞的损伤。

细胞凋亡是由基因调控的细胞有序的程序性死亡，维持机体稳定，清除损伤及多余的细胞。内质网应激途径、死亡受体介导途径及内部线粒体途径等都是真核生物细胞凋亡的经典途径，基因调控起到重要作用。bcl-2基因是标志性的凋亡抑制基因[9]，位于18q21，bcl-2/bax比例增高时，形成同源bcl-2二聚体，抑制细胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶(caspase)在细胞凋亡通路中起到重要作用，目前发现的有14种成员，其中caspase-3是细胞凋亡过程中的关键酶，活化的caspase-3可以在天冬氨酸残基处降解或切割重要的蛋白质，改变其结构功能，引起细胞凋亡[10-12]。bcl-2可抑制促凋亡因子caspase-3的合成及活化，抑制凋亡的信号级联反应，从而发挥阻滞细胞凋亡的作用。本实验结果显示，ESC能明显增加胰岛βTc3中bcl-2基因mRNA的表达；明显降低细胞caspase-3基因的表达。

综上所述，ESC能明显增加凋亡抑制基因bcl-2 mRNA的表达并降低caspase-3基因的表达，从而减少βTc3细胞的凋亡，对高脂培养的胰岛βTc3细胞起到保护作用。