ISL-1生物学特性及其在窦房结发育、生物起搏中作用的研究进展

范致星，黄从新

1武汉大学人民医院，武汉 430060;2武汉大学心血管病研究所;3心血管病湖北省重点实验室

窦房结(SAN)作为心脏的生理起搏点，可参与调控不同生理状态下的心脏节律。随着人口老龄化，窦房结退行性变的发生率逐渐上升，其功能改变所引起的头晕、黑朦、乏力、甚至猝死，被称为病态窦房结综合征(SSS)[1]。心脏电子起搏器在世界范围内已经得到了广泛的使用，可明显改善SSS患者的生活质量。然而，电子起搏器仍有较多的缺陷和局限，如需永久性植入导管、电池寿命较短、不受神经体液因素调控等[2]。于是构建一种“生物起搏器”显得至关重要。生物起搏是指运用各种方法(如基因工程)构建一个与窦房结功能类似的起搏点，在机体正常起搏系统出现异常时发挥替代作用[3]。近年来，生物起搏器构建相关研究多集中在诱导干细胞的定向分化或调控下游的离子通道，虽然取得一定的效果，但仍存在许多不足[4]。转录因子胰岛素基因增强子结合蛋白1(ISL-1)是SAN发育的关键调控因子，其在SAN的形成和发育中起着重要的作用，过表达ISL-1有助于起搏样细胞的形成[5]。现就ISL-1的生物学特性及其在窦房结发育、生物起搏中的作用研究进展情况综述如下。

1 ISL-1的生物学特性

ISL-1于1990年由Karlsson教授等[6]首次报道。人类ISL-1基因全长约11 kb，定位在5号染色体的长臂，含6个外显子。ISL-1蛋白属于LIM同源框蛋白家族，总共含349个氨基酸。ISL-1转录因子由三个结构域构成，包括一个同源结构域和两个相互串联的LIM结构域。LIM结构域高度保守，主要含有组氨酸及半胱氨酸，这种结构域可通过形成锌指结构而介导蛋白与蛋白间的作用[7]。ISL-1的同源结构域为螺旋结构，该种结构有利于其与靶基因的ATTA或TAAT元件偶联，从而介导蛋白与基因间的作用[6,7]。

目前已有研究证实，ISL-1可作为第二生心区(SHF)心脏前体细胞的分子标志[8]。Pandur等[9]发现，ISL-1基因敲除小鼠在鼠胚第9.5天停止心脏发育或心脏出现严重畸形，不能成袢；进一步采用原位杂交法发现，ISL-1基因敲除小鼠左室虽然不受影响，但表现为单个心房或心室，同时伴右室及流出道缺如。Mommersteeg等[10]通过谱系示踪分析法研究ISL-1在小鼠胚胎发育第7.25～10天时的表达情况，发现ISL-1在新月形生心区的腹侧和背侧处表达较高，当线性心管形成后，脏壁中胚层和前肠内胚层中逐渐出现ISL-1阳性细胞，在小鼠胚胎发育到第10天时，依然能在脏壁及腹侧中胚层检测到ISL-1，然而在心肌成熟后却不能检测到ISL-1的表达。进一步研究显示，在小鼠胚胎发育到第8.5天时，ISL-1阳性前体细胞迁移到心脏，在右室流出道及右心房、右心室表达，但在其他部位未检测到；随着心脏逐渐发育，右房ISL-1表达明显升高，最后仅局限于右房的起搏区域；在胚胎发育到第14.5天时，ISL-1在心脏神经节区域、SAN和房室结(AVN)区域、房间隔、部分流出道、右室、主动脉、肺动脉、静脉瓣等部位持续表达；在小鼠出生后第3天，ISL-1仍可在主动脉/肺动脉基部、窦房结及房室结区域表达，但ISL-1表达区域明显缩小[10]。ISL-1持续在SAN及AVN区域表达提示起搏细胞有可能来源于SHF。同时研究还发现，ISL-1与起搏细胞标志超极化激活环核苷酸门控通道4(HCN4)在部分区域可同时表达，这说明ISL-1与HCN4的表达可能密切相关[10]。另一研究中研究人员将ISL-1与不同细胞系的细胞表面分子标志物进行共染色，发现SAN及AVN区域有一群ISL-1阳性前体细胞并无特定细胞系相关的分子标志物，且随着胚胎发育，其细胞数量明显减少[11]。这提示ISL-1阳性前体细胞具备分化为其他不同细胞系的潜能。Weinberger等[12]发现，人类胚胎期的ISL-1也高表达于右房及流出道等SHF结构区，这与小鼠相似，还发现ISL-1也可表达于正常成年小鼠心脏中，但主要在上腔静脉与右房交汇处、肺静脉及房间隔周围、大血管壁内。更有趣的是，上腔静脉与右房交汇处的ISL-1阳性前体细胞高表达HCN4，这说明ISL-1同样是成熟SAN的标志。

2 ISL-1在SAN发育中的作用

SAN是一个高度专业化的结构，位于上腔静脉与右心房交界处的界沟上1/3的心外膜深面[13]。SAN起搏细胞通过细胞膜上的多种离子电流(膜时钟)和细胞内的钙循环(钙时钟)相互影响导致起搏活动的产生[14～16]。调控SAN发育的分子信号网络十分复杂，涉及多种转录因子的多重调控和相互作用，不同的转录因子在SAN及周围心房工作心肌中呈现出特定的表达模式，在细胞的特异性和分化过程中起着关键的作用[17,18]。近年相关研究证实，ISL-1可作为SAN起搏细胞的标志，参与SAN的发育及功能调控。Tessadori等[19]首先证实了ISL-1可调控斑马鱼SAN的发育及功能。Vedantham等[20]同样证实，ISL-1作为与发育相关的重要转录因子，可从上游调控多种转录因子及离子通道的表达而参与小鼠SAN的发育。后续的研究进一步证实，ISL-1在哺乳动物SAN胚胎期发育过程中也发挥了至关重要的作用，ISL-1可作为SAN起搏细胞的标志[20]。研究者采用激光捕获显微切割技术分离纯化得到了小鼠SAN中的起搏细胞并完成测序，发现基因敲除ISL-1后，在SAN中表达丰富的T-box转录因子家族3(Tbx3)、HCN4等基因的表达明显降低，而右房心肌表达丰富相关的基因出现了显著的上调[20]。这提示ISL-1作为转录因子，参与对SAN相关基因的直接调控。Liang等[5]通过ISL-1基因敲除小鼠实验，证实了ISL-1作为转录因子，参与了SAN的胚胎发育，对SAN起搏细胞的存活及功能至关重要。染色质免疫沉淀反应证实，L型钙通道、ANK2及Tbx3等多种窦房结起搏功能必需的基因中存在ISL-1的结合位点，受到ISL-1调控的SAN特异表达的基因达到40%[5]。SAN是哺乳动物自发电活动的结构基础，ISL-1是SAN起搏细胞的标志，对其发育和功能起到重要作用。因此，在生物起搏领域，转录因子ISL-1受到越来越多的重视，成为研究热点。

3 ISL-1在生物起搏中的作用

生物起搏是运用分子生物学及其相关技术，对受损的自律性节律点或特殊传导系统的组织进行修复和替代，使心脏的传导或起搏功能得以恢复。因此，获得有效的起搏样细胞是最终实现生物起搏的前提。近年研究证实，ISL-1阳性前体细胞可能具有多向分化潜能，过表达ISL-1有助于起搏样细胞的形成。Laugwitz等[21]发现，将ISL-1阳性前体细胞与心脏间充质细胞共培养一段时间后，ISL-1阳性细胞不仅可以维持未分化状态而且能实现自我更新；将ISL-1阳性细胞与已经分化成熟的心肌细胞共培养，这些ISL-1阳性细胞能够分化为心肌样细胞。Moretti等[22]及Bu等[23]同样发现，在不同的诱导条件下，ISL-1阳性细胞可分化形成不同的心脏细胞系。随后，Fonoudi等[24]在胚胎干细胞中过表达ISL-1，证实过表达ISL-1可促进人胚胎干细胞向心肌样细胞分化。这些研究均提示ISL-1可作为将特定类型细胞转化为心肌样细胞或者起搏样细胞的有效转录因子，可能是研发缓慢性心律失常生物起搏器的关键靶点。Zhang等[25]通过基因转染方式在脂肪干细胞(ADSCs)中过表达ISL-1，结果发现ISL-1在ADSCs中高表达后，HCN4、Cx45 和 Tbx3等窦房结特异性基因在ADSCs中的表达明显上调，而Nkx2.5等工作心肌特异性基因表达显著下调，且可记录到超极化激活的起搏电流(If)。这项研究结果表明经ISL-1基因修饰的ADSCs产生了一定的高表达窦房结标志性基因并具有细胞内典型超极化电活动的起搏样细胞。与此同时，Zhang等[26]通过基因转染的方式将ISL-1和Tbx18两者一并整合至乳鼠心室肌细胞(NRVM)的基因组中，结果发现ISL-1组、Tbx18组和ISL-1+Tbx18组NRVM搏动频率均有明显提升，各组均可检测到HCN4的表达，但ISL-1+Tbx18组HCN4表达水平最高，搏动频率提升最为明显，且ISL-1+Tbx18联合表达的大多数NRVM能记录到If电流。此项实验表明，ISL-1+Tbx18共表达能更明显的提高HCN4的表达水平，促进NRVM向窦房结细胞转化，实现起搏样细胞的重编程。综合上述两项最新研究结果我们可以看到，转录因子ISL-1能在特定条件下，将脂肪干细胞或已经成熟的心肌细胞诱导为起搏样细胞。但一种转录因子作用往往有限，同时联合多种转录因子可能更有利于实现起搏样细胞的重编程，多种转录因子联合作用将是后续研究生物起搏新的突破点。

与此同时，我们还需认识到ISL-1构建生物起搏器可能存在的不足。ISL-1作为胚胎性基因，在人类发育过程中，ISL-1只在特定的组织或器官中表达，例如胰腺和大脑。在成年后的组织或器官中高表达ISL-1，将抑制抑癌基因p14ARF等细胞周期调节因子的表达，促进细胞的自我更新，最终导致淋巴瘤、胃癌和膀胱癌等多种肿瘤的发生[27,28]。此外，ISL-1通过调节心脏的起搏及传导，相关基因还可导致新的心脏传导系统疾病及心律失常[29]。总之，ISL-1的生物安全性还有待进一步研究。

综上所述，ISL-1作为一种与发育调控有关的重要转录因子，其在促进窦房结发育及维持窦房结起搏功能中扮演了重要的角色。ADSCs等种子细胞过表达ISL-1后可通过上调Tbx3、HCN4等SAN特异性基因，同时下调Nkx2.5等工作心肌特异性基因而使细胞形成If，最终分化为起搏样细胞。鉴于ISL-1可参与对SAN特异性相关基因的表达调控，未来可将ISL-1作为生物起搏研究的重要诱导因子并深入探讨其相应机制。但截止目前，由于生物起搏涉及的调控机制极其精确且复杂，该领域的研究还仅仅是在实验的初期，ISL-1构建生物起搏器的稳定性、持久性及生物安全性问题仍需更进一步研究。