鼻咽癌放疗抵抗机制的研究进展

吴丽芷，陈始明

武汉大学人民医院，武汉 430060

鼻咽癌(NPC)是起源于鼻咽黏膜上皮的恶性肿瘤，危险因素包括EB病毒(EBV)、人乳头瘤病毒感染，遗传易感性及饮食等生活习惯[1]。据流行病学调查统计显示，2018年全球NPC的新发病例约有129万例。调查还发现，NPC地理分布极不平衡，近70%以上的新发病例发生在东亚和东南亚地区[2]。由于鼻咽部解剖结构复杂，且周围邻近重要器官，故难以进行手术根治性切除。且NPC的病理类型绝大多数为非角化型未分化性癌，恶性程度高，易发生颈部淋巴结转移。由于对电离辐射(IR)高度敏感，因此放射治疗是目前NPC首选的治疗手段[3]。然而，大量研究表明，IR杀灭肿瘤的同时也可以诱导许多基因和蛋白质表达水平的变化，这些变化可导致肿瘤对IR的敏感性降低，并出现辐射抗性或辐射抗性的发展。放射抗性是NPC治疗失败的主要原因[4]。因此，探索NPC放射抗性的分子机制对于提高NPC放射治疗效果乃至改善NPC患者预后至关重要。

放疗抵抗的产生是一个多基因和多机制共同参与的过程，包括具有高度致瘤原性的肿瘤干细胞(CSC)，通过激活DNA损伤修复抗凋亡；肿瘤细胞葡萄糖摄取增加、线粒体氧化磷酸化减少，以高效修复DNA；通过自噬提供能量和消除已经被辐射损伤的蛋白质促进细胞存活；调控细胞周期重新分布，使其对放疗敏感性减弱；且EBV编码的潜伏膜蛋白1可诱导NPC CSC形成[5]。现将NPC放疗抵抗机制的研究进展情况综述如下。

1 CSC

1983年，Mackillop等[6]最先提出CSC的概念，认为其是肿瘤细胞中一类具有干细胞特性的异质性细胞。但是，与其他肿瘤细胞不同的是肿瘤干细胞具有无限的自我更新能力和高度的致瘤原性，这些特性使CSC成为肿瘤生长和复发的根源。因此，CSC是肿瘤诊断，治疗及预测预后的重要标志，也是癌症治疗的新靶标[7]。Krause等[8]提出，CSC通过多种机制介导癌症中放射抗性的发生，例如激活DNA损伤修复及抗凋亡途径，清除活性氧防止不可逆的氧化应激和细胞死亡，以及改变肿瘤微环境等。

Zhong等[9]在研究RARS-MAD1L1在NPC放疗抵抗中的作用和机制中发现，RARS-MAD1L1过表达将增加NPC细胞的集落形成能力和体外致瘤性，增加侧群细胞(一群富含CSC的群体)比率并诱导放疗抵抗。此外，RARS-MAD1L1可以抑制AIMP2从ARS复合物中释放，减少TRAF2的泛素化，导致NF-κB活性升高，抑制细胞凋亡[10]。FUBP1的沉默或c-Myc抑制剂的使用可以消除由RARS-MAD1L1诱导的CSC特征。Wang等[11]在NPC细胞系中筛选出干细胞样亚群(PKH26+)，PKH26+亚群中c-Myc的过表达导致CHK1和CHK2的表达增加，并随后激活DNA损伤检查点，引起细胞周期停滞，激活相关DNA损伤修复蛋白从而引起放疗抵抗。

CSC特异性治疗是一种非常有前景的肿瘤靶向治疗。CSC的潜在靶向可以以不同的方式实现，包括靶向CSC相关分子，干扰促进CSC功能的环境或抑制对CSC维持和存活至关重要的分子途径。然而，由于大多数CSC标记物在正常组织干细胞中也有表达，因此CSC靶向治疗可能影响正常组织干细胞的信号传导机制，导致产生严重的副作用进而影响其临床使用[12]。

2 肿瘤细胞代谢

越来越多的研究报道证实，放射抵抗的产生与癌细胞的代谢改变相关。放射抵抗的癌细胞表现出Warburg效应，即葡萄糖摄取增加和线粒体氧化磷酸化减少[13～15]。AMPK是癌细胞中Warburg效应的负调节因子，Lu等[16]通过激活NPC细胞中的AMPK抑制Warburg效应后发现NPC细胞体内、体外的放射敏感性均得到明显增强。此外，谷氨酰胺代谢也被证明在放射抗性中起关键作用。谷氨酸是谷胱甘肽合成的前体，其可以调节氧化还原稳态，从而有助于细胞防御系统。有研究发现，谷氨酸的抑制可显著增加癌细胞的放射敏感性，证实谷氨酰胺代谢在放射抗性中的起了重要作用[17]。研究[17]证实，在抗辐射NPC细胞中谷氨酰胺合成酶高表达，从而促进其核苷酸生物合成并进行更高效的DNA修复，以获得生存优势和抗辐射的特点。

3 DNA损伤修复

放射治疗主要是通过IR直接或间接地损伤癌细胞DNA，引起癌细胞碱基破坏、DNA双链或单链断裂。不同类型的DNA损伤可被相应的DNA修复机制修复，如碱基切除修复、DNA双链断裂修复、核苷酸切除修复及错配修复。由于DNA双链断裂是最严重的损伤，且较其他损伤更难以修复，DNA双链断裂后未修复或者错误修复均会导致细胞死亡或者恶变[18]。细胞暴露于IR会导致核中的表皮生长因子受体(EGFR)活化，活化后的EGFR通过非同源性末端接合(NHEJ)和同源重组(HR)刺激DNA双链断裂修复。You及其团队选取Ⅱ～Ⅳb期NPC患者1 628例，将其分为两组，对照组采取放化疗治疗，观察组在对照组基础上加用抗EGFR靶向治疗，结果显示与单纯放化疗相比放化疗联合抗EGFR靶向治疗可显著提高Ⅱ～Ⅳb期NPC患者的总生存时间，并且改善了无远处转移生存率[19]。通过研究RBM3在NPC患者病理组织标本中的表达情况发现，高RBM3表达的NPC患者往往伴有放疗抵抗[20]。同时检测出抗辐射NPC细胞CNE1R中RBM3的表达较亲代CNE1细胞群RBM3的表达明显上调。进一步研究发现，下调NPC细胞中的RBM3水平可以在体内和体外明显提高其放射治疗敏感性，这可能与RBM3激活PI3K/AKT/Bcl-2信号通路有关，因为Bcl-2的上调减少了IR引起的DNA损伤。

近年来，抗DNA损伤修复(DDR)已经成为肿瘤药物开发的一个热点。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂是目前研究最广泛的DDR抑制剂，其通过结合到PARP1和(或)PARP2的NAD+结合口袋，引起构象异构，造成DNA-PARP的不可逆解离，使PARP保持对DNA的结合，这个过程被称为DNA-PARP复合物的“捕获(诱捕)”，这导致DNA-PARP复合物长期存在，无法进行后续的修复，从而提高肿瘤细胞的放疗敏感性[21]。目前，PARP抑制剂的临床试验适应症研究已经扩展到肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、头颈部肿瘤等[22]。

4 自噬

自噬是细胞在面对能量缺乏，暴露于细胞毒性物质或IR等应激状态时，通过溶酶体降解细胞内受损的蛋白质或者细胞器，维持细胞内环境的稳态的一种自我保护机制，包括大自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬[23]。自噬在肿瘤发生和发展中的作用是复杂和矛盾的。一方面，自噬通过消除细胞中错误折叠的蛋白质来抑制肿瘤的发生。另一方面，在肿瘤进展的晚期，自噬通过提供能量和消除已经被药物和辐射损伤的蛋白质来促进细胞存活[24]。许多研究表明，自噬通过减少细胞损伤和抑制辐射诱导的细胞凋亡来促进辐射后细胞的存活，是各种肿瘤放射抵抗的基础，包括肺癌[25]、肝细胞癌[26]和结肠直肠癌[27]。Liang及其团队使用体外分次辐射的方法构建出抗辐射的NPC细胞系CNE-2R，对其分别进行自噬抑制及激活的处理，实验结果显示：放疗联合自噬抑制剂显著抑制了CNE-2R细胞的增殖，促进其凋亡。相反，自噬的激活导致放射抵抗产生[28]。此外还有文献[29]报道，LAPTM4B是自噬的关键调节因子，其通过与EGFR、Beclin1相互作用介导自噬的起始。敲低LAPTM4B可以降低放射抵抗细胞的存活率，并且在IR后增加其凋亡的发生。

5 细胞周期调控

细胞周期是指细胞从一次分裂结束开始，到下一次分裂完成所经历的过程，它受细胞周期蛋白(Cyclin)、周期蛋白依赖性激酶(CDK)、周期蛋白依赖性激酶刺激抑制因子(CKI)等多种特异性蛋白的调控[30]。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是调控细胞周期中G1期的关键蛋白之一，Cyclin D1高表达与肿瘤的发生、发展有重要关系，其通过变构调控细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和CDK6，调节细胞周期从G1期向S期转变[31]。

细胞对放射治疗的敏感性与细胞周期的关系非常密切，活跃分裂的肿瘤细胞更容易受到辐射的伤害，因此细胞在G2期～M期间对辐射最敏感，在晚期S期对辐射最不敏感[32]。有研究[33]表明，SHP-1(含SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶1)通过上调CyclinD1的表达促进NPC细胞从G1期提前进入S期，加快NPC细胞增殖。利用shRNA技术降低内源性SHP-1表达后，NPC细胞成瘤能力和侵袭转移能力显著减弱，放疗敏感性增强。这提示SHP-1基因沉默有可能通过调节CyclinD1的表达影响NPC细胞的细胞周期分布，增加其放疗敏感性。

胎盘特异蛋白8(PLAC8)是一种富含半胱氨酸的蛋白，它首次发现于人类胎盘组织中，与人体内多种肿瘤的发生有密切关系。研究[34]发现，PLAC8体内及体外均具有促进NPC细胞侵袭和转移的作用，其分子机制是特异性激活TGF-β/SMAD信号通路并诱导NPC细胞上皮间质转化。我们对PLAC8与NPC的放疗敏感性也进行了深入研究，发现敲除PLAC8基因的NPC细胞在放射治疗后的凋亡数目显著上升，G2/M期细胞比例也上升；敲除PLAC8基因可显著提高NPC细胞的放疗敏感性[35]。这些研究为包括放疗增敏在内的NPC靶向治疗提供了新的方向。

6 EBV

EBV是γ疱疹病毒家族的成员之一，在全世界感染率极高，血清检测阳性率高达90%以上。NPC的发生与EBV的感染密切相关。研究[36]证实，EBV所编码的miR-BART4在NPC中抑制PTEN的表达，进而促进NPC转移，抑制细胞凋亡，导致放疗抵抗。潜伏膜蛋白1(LMP1)是EBV编码的主要癌蛋白[37]。据报道[38]，LMP1激活PI3K/AKT信号通路刺激CSC标记物的表达，诱导NPCCSC特性的形成。同时PI3K/AKT这一信号通路也被LMP1诱导的CSC标记物激活，形成一正反馈效应。此外，EBV还分泌多种抗凋亡蛋白，如BHRF1、BARF1、EBNA1、ERER、miR-BART，这些均导致NPC细胞对放疗产生抵抗[39]。还有研究[40]表明，LMP1上调己糖激酶2的表达，促进NPC细胞进行有氧糖酵解，并显著抑制线粒体依赖的细胞凋亡，以此为靶向抑制LMP1表达可使NPC细胞放射增敏性提高。

综上所述，CSC、DNA损伤修复、代谢、自噬、细胞周期调控及EBV是NPC放疗抵抗的相关机制，在以后的NPC放射治疗中，我们可以选择合适的靶向药物，特别是针对NPC CSC及DNA修复途径的蛋白质，与放射治疗联合使用，以期探索出逆转放疗抵抗的干预措施，从而开发出提高NPC放疗疗效、降低NPC复发和转移的新途径。这也将是NPC未来研究的难度与热点之一。