ε-聚赖氨酸对腐生葡萄球菌细胞结构与能量代谢的影响

蓝蔚青，张楠楠，陈梦玲，谢 晶,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306）

ε-聚赖氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一种具有抑菌功效的阳离子多肽，具有抑制效果好、抑菌性广等优点[1]。研究表明，ε-PL的抑菌机制主要为作用于细胞膜和细胞壁导致细胞死亡，对细菌的呼吸作用有一定影响，同时还可能作用于酶或功能蛋白系统[2-4]。

腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）是食品中的主要腐败菌，为革兰氏阳性菌，能在食品贮藏过程中分泌蛋白酶与脂肪酶，导致蛋白质降解与脂质氧化，影响其品质[5-6]。目前也有相关学者开展对腐生葡萄球菌的抑菌机理研究，如苏萌萌等[7]研究发现绿原素能作用于腐生葡萄球菌细胞膜，使细胞膜严重受损，导致膜电位发生变化，胞内大分子物质泄漏而达到抑菌目的；朱亚珠等[8]通过实验得出山梨酸钾、双乙酸钠与异抗坏血酸钠组成的复合保鲜剂能明显降低腐生葡萄球菌的生长速率，使菌体破裂，核酸与蛋白质外泄，导致其死亡。但目前开展抗菌多肽对腐生葡萄球菌作用机制方面的研究较少。相关研究表明，抗菌肽抑菌剂破坏细菌细胞结构后，其进入菌体细胞内，可能会影响细胞代谢[9]。三羧酸循环是生物细胞中重要的代谢途径，其不仅能提供能量，还是糖、脂肪与蛋白质转化的枢纽。琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）与苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH）是三羧酸循环中重要的调控酶，会对三羧酸循环，甚至整个细胞代谢带来影响[10]。本研究以ε-PL对腐生葡萄球菌细胞膜影响为出发点，由细菌生长曲线、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶、电导率、紫外吸收值与扫描电子显微镜观察，研究ε-PL对腐生葡萄球菌细胞结构的影响，并通过检测琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）、苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH）、过氧化物酶（peroxidase，POD）与过氧化氢酶（catalase，CAT）等呼吸代谢关键酶活性变化，进一步探究ε-PL对腐生葡萄球菌能量代谢的作用机制。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）为课题组前期从腐败大黄鱼中分离、筛选、鉴定并保存的菌株。

胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基 青岛海博生物技术有限公司；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、AKP测试盒、超微量总ATP酶测试盒以及POD、CAT、SDH、MDH试剂盒 南京建成生物工程研究所；氯化钠、无水乙醇、戊二醛、磷酸盐、氯化碘硝基四唑紫（iodonitrotetrazolium chloride，INT）等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BCD-256KF冰箱 青岛海尔股份有限公司；MLS-3750灭菌锅 日本SANYO公司；ZQZY-70B振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；LDZM-40KCS-II立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；VS-1300L-U型超净台 苏州苏净安泰集团；M334712全自动微生长曲线分析仪 芬兰Bioscreen公司；Centrifuge 5810R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Synergy2自动酶标仪 美国BioTek公司；DDB-11A电导率仪 杭州奇威仪器有限公司；S3400N扫描电子显微镜 日本Hitachi株式会社。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备

挑取单菌落于10 mL TSB培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养18 h，以1%（体积分数，后同）接种量接入10 mL的TSB培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养18 h，4 ℃、3 500 r/min离心15 min，弃去上清液，用0.85%生理盐水调整菌液，菌液浓度为106～107CFU/mL，现配现用。

1.3.2 最小抑菌浓度测定

采用肉汤稀释法测定ε-PL对腐生葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），即7 ℃下培养24 h，明显抑制微生物生长的最小浓度[11]。收集对数生长期的菌液，加入无菌TSB培养液稀释至106CFU/mL。采用二倍稀释法将ε-PL在无菌TSB中依次稀释，使其终质量浓度分别为32、16、8、4、2、1 mg/mL，用无菌水代替ε-PL作为对照组。37 ℃下培养24 h。通过比较ε-PL处理前后的吸光度变化，得出其MIC为1.0 mg/mL。

1.3.3 细菌生长曲线的绘制

将已制备的菌悬液按1%接种量分别加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加ε-PL为对照组（CK）。37 ℃、170 r/min摇床培养24 h，用全自动微生物生长曲线分析仪每隔1 h自动测定600 nm波长处的OD值。

1.3.4ε-PL处理后腐生葡萄球菌细胞壁、细胞膜通透性的测定

将制备好的菌悬液按1%接种量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加ε-PL为对照组。37 ℃、170 r/min摇床培养，每隔2 h取样1次，3 500 r/min离心10 min，取上清液，按照AKP和超微量总ATP酶测试盒进行AKP和ATP酶活力测定，研究ε-PL对菌体细胞壁通透性的影响；测定上清液在260 nm波长处的OD值，研究ε-PL对细胞膜通透性的影响；用电导率仪测定上清液的电导率，研究ε-PL对细胞内容物泄漏的影响。

1.3.5 扫描电子显微镜观察菌体形态

将制备好的菌悬液按1%接种量分别加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，37 ℃、170 r/min摇床培养12 h后，取2.0 mL菌液于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集沉淀。用2.5%戊二醛溶液重悬，并在4 ℃固定10 h。用磷酸盐缓冲液洗涤菌体后，再用30%、50%、70%、90%乙醇溶液和无水乙醇依次进行梯度脱水。冷冻干燥后，将其涂于金属载体上，喷金，进行扫描电子显微镜观察。

1.3.6ε-PL处理后腐生葡萄球菌POD和CAT活力的测定

参考廖石榴等[12]的方法，将制备好的菌悬液按1%接种量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加ε-PL为对照组。37 ℃、170 r/min摇床培养。取10 mL低温下超声2 min，4 ℃、5 000 r/min离心12 min。取上清液，用试剂盒测定POD和CAT活力。

1.3.7ε-PL处理后腐生葡萄球菌SDH和MDH活力的测定

参考廖石榴等[12]的方法，将制备好的菌悬液按1%接种量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加处理液组为对照。37 ℃、170 r/min摇床培养。取2 mL菌液，3 000 r/min离心15 min。将沉淀物用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）洗涤3 次。向菌体中加入等体积的2 g/L溶菌酶，于38 ℃下作用15 min，取出后冰浴；加入Tris-十二烷基硫酸钠缓冲液后，4 ℃、5 000 r/min离心15 min，取上清液用试剂盒进行SDH和MDH活力测定。

1.3.8ε-PL处理后腐生葡萄球菌细胞代谢活力的测定

参考刘唤明等[13]的方法，将制好的菌悬液按1%接种量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，37 ℃作用1 h后，在4 ℃、10 000 r/min条件下离心5 min，收集沉淀物。用生理盐水洗涤2 次并将菌液浓度调至108CFU/mL，加入INT，使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃作用30 min后，测定OD630nm，判断ε-PL对菌体细胞代谢活力的影响。

1.4 数据处理与分析

以SPSS 17.5软件中的单因素方差分析及Duncan新复极差法进行数据的差异显著性分析，采用Origin 9.0软件绘图。最终实验数据均为3 次平行实验的平均值，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 ε-PL对腐生葡萄球菌生长曲线的影响

使用全自动微生物生长曲线测定仪测定腐生葡萄球菌在不同质量浓度ε-PL作用下的生长情况，结果如图1所示。

图1 ε-PL对腐生葡萄球菌生长曲线的影响Fig.1 Effect of ε-PL on the growth curve of Staphylococcus saprophyticus

由图1可知，CK组的腐生葡萄球菌生长呈“S”型，2～13 h为对数期，该阶段菌体数量增长迅速，13 h后进入稳定期。与CK组相比，MIC组与2 MIC组菌体在2～13 h时的生长速度减慢，在13 h进入稳定期，MIC组与2 MIC组菌体数量小于对照组。可见，经MIC和2 MICε-PL处理后，腐生葡萄球菌的生长受到明显抑制。

2.2 ε-PL对腐生葡萄球菌AKP活力的影响

AKP大多存在于细胞壁与细胞膜间。当细胞结构受到破坏，AKP由胞内渗出。因此，可通过检测AKP的活力来判断其对菌体细胞壁的破坏情况[14]。

从图2可知，在0～2 h时，3 组样品的AKP活力增长较快。2 h后MIC组和2 MIC组的AKP活力要高于对照组。其中，2 MIC组AKP活力增长更明显。表明ε-PL处理能使腐生葡萄球菌的细胞壁通透性发生改变，导致AKP活力增加。这是由于ε-PL富含阳离子，会取代细胞壁表面的Ca2＋、Mg2＋，与负电性的脂多糖结合，导致细胞壁结构发生改变，从而穿过细胞壁作用于细胞膜。这与韩晴[15]的研究结果一致。

图2 ε-PL对腐生葡萄球菌菌体AKP活力的影响Fig.2 Effect of ε-PL on AKP activity of Staphylococcus saprophyticus

2.3 ε-PL对腐生葡萄球菌总ATP酶活力的影响

ATP酶是广泛分布在细胞膜上的酶，其主要是通过利用ATP水解产生的能量对Na＋、K＋、Ca2＋、Mg2＋等进行由低浓度至高浓度的运输，保持膜内外离子浓度的平衡，维持正常的生命活动[16]。因此，可通过ATP酶活力变化分析其对菌体细胞能量代谢的影响[17]。

图3 ε-PL对腐生葡萄球菌总ATP酶活力的影响Fig.3 Effect of ε-PL on ATPase activity of Staphylococcus saprophyticus

由图3可知，CK组菌液的ATP酶活力变化不明显，保持相对平稳。而经MIC与2 MIC的ε-PL处理后，其ATP酶活力活力随处理时间延长而降低。可能由于ε-PL作用于菌体后，导致其细胞膜受损，造成胞内的ATP酶活力下降[18]。因此，ε-PL的抑菌作用可使其能量代谢受到抑制，影响细胞供能等。该结果与Lin Lin等[18]的研究结果一致。

2.4 ε-PL对腐生葡萄球菌细胞膜通透性的影响

细胞膜被破坏后，导致膜内物质泄漏出来[19]。因此，可通过检测菌液在260 nm波长处的光密度来分析其对细胞膜的破坏程度[20]。

由图4可知，随着作用时间的延长，MIC组与2 MIC组菌液的OD值增加，且在2 h内明显增加，随后缓慢增长，而CK组菌液的OD值始终保持低水平。可见，ε-PL对菌体的细胞膜有一定破坏作用，破坏强度与ε-PL质量浓度呈正相关。菌液中胞外核酸含量的增加趋势与周祺等[21]的结果一致，表明ε-PL对菌体细胞膜有破坏作用。

图4 ε-PL对腐生葡萄球菌细胞膜完整性的影响Fig.4 Effect of ε-PL on cell membrane integrity of Staphylococcus saprophyticus

2.5 ε-PL对腐生葡萄球菌电导率的影响

当抑菌剂破坏细胞膜后，细菌内部电解质外泄至培养液中，使电导率增加。因此，可通过菌液电导率的变化来分析其细胞膜的通透性变化[22]。

图5 ε-PL对腐生葡萄球菌细胞膜通透性的影响Fig.5 Effect of ε-PL on cell membrane permeability of Staphylococcus saprophyticus

由图5可知，随着处理时间的延长，3 组菌液的电导率均随之增加。其中，CK组菌液在2 h内的电导率增加较明显，随后缓慢增长，并维持在相对稳定状态。MIC与2 MIC组菌液的电导率始终高于CK组，其与处理液浓度呈正相关。可能是ε-PL破坏细胞膜，导致菌体膜破裂，胞内大量物质泄漏，影响其正常代谢，最终导致菌体死亡[23]。

2.6 ε-PL对腐生葡萄球菌细胞形态的影响

CK组与ε-PL处理组中的腐生葡萄球菌扫描电子显微镜观察结果如图6所示。

图6 ε-PL对腐生葡萄球菌处理前后扫描电子显微镜图Fig.6 Scanning electron micrographs of Staphylococcus saprophyticus cells treated or not treated with ε-PL

由图6可知，CK组菌体形态饱满、完整未变形；经MICε-PL处理后的菌体扭曲变形、表面粗糙。而经2 MICε-PL处理后，菌体在扭曲变形的同时，部分细胞相互黏结，形态破坏较明显。表明ε-PL能破坏菌体形态，改变其通透性，达到抑菌效果。这与Li Yingqiu等[24]研究结果一致。

2.7 ε-PL对腐生葡萄球菌POD和CAT活力的影响

POD与CAT是细胞内重要的保护酶，能清除活性氧自由基，保证细胞膜结构完整性[25-26]。其酶活力的降低会造成菌体的膜系统受损，影响细胞的正常生长代谢[12]。

图7 ε-PL对腐生葡萄球菌POD和CAT活力的影响Fig.7 Effect of ε-PL against on POD and CAT activity of Staphylococcus saprophyticus

由图7可知，菌体经MIC与2 MICε-PL处理后，其POD和CAT活力低于CK组。随着ε-PL质量浓度的增加，POD和CAT活力相应下降。可见，ε-PL可通过降低腐生葡萄球菌的POD、CAT活力，减缓其呼吸代谢，从而抑制菌体生长。

2.8 ε-PL对腐生葡萄球菌SDH与MDH活力的影响

SDH与MDH是三羧酸循环过程中的关键代谢酶[27-28]。因此，通过检测腐生葡萄球菌中SDH和MDH活力可反映菌体的能量代谢状况[29]。

图8 ε-PL对腐生葡萄球菌MDH和SDH活力的影响Fig.8 Effect of ε-PL on MDH and SDH activity of Staphylococcus saprophyticus

如图8所示，与CK组相比，ε-PL处理组的SDH与MDH活力降低，且随着ε-PL质量浓度的增加，SDH活力逐渐降低，MDH活力的变化趋势与SDH相似。结果表明ε-PL会降低腐生葡萄球菌的SDH与MDH活力，且ε-PL质量浓度越高，酶活力越低。可能是ε-PL主要通过抑制SDH和MDH活性，使三羧酸循环受阻，影响菌体正常的能量代谢，导致其细胞生长受阻。此结果和Yang Shuzhen等[30]研究结果一致。

2.9 ε-PL对腐生葡萄球菌细胞代谢活力的影响

细胞代谢还原活力基于INT原理进行测定。三羧酸循环过程中，活细胞在脱氢酶作用下生成活化氢离子，其将INT还原成甲臜，可根据甲臜生成速率推测细胞代谢活力[31]。ε-PL对腐生葡萄球菌代谢活力的影响结果见图9。

图9 ε-PL对腐生葡萄球菌细胞代谢活力的影响Fig.9 Effect of ε-PL on cell metabolism of Staphylococcus saprophyticus

由图9可知，ε-PL处理组的OD值低于对照组，且2 MIC组的OD值低于MIC组，说明ε-PL能抑制腐生葡萄球菌的代谢活性。可能是ε-PL作用于腐生葡萄球菌，导致细胞结构改变，内容物泄漏，对其代谢活力产生影响。

2.10 综合分析结果

细胞膜是细菌结构的重要组成部分，是各种抗菌剂作用的主要场所。当细胞膜被破坏时，核酸等大分子与Na＋、K＋离子等内容物发生泄漏，由此可判断细胞膜完整性[19,22]。图10模拟还原了ε-PL破坏腐生葡萄球菌的细胞结构以及导致其内容物泄漏的过程。

图10 ε-PL对腐生葡萄球菌抑制模拟图[25]Fig.10 Schematic representation of the possible inhibitory mechanism of ε-PL against Staphylococcus saprophyticus[25]

ε-PL可进入细胞内膜降低腐生葡萄球菌的AKP与ATP活性，抑制其生长。ATP酶是一种基础代谢酶，能催化ATP生成ADP，为细胞提供能量。ATP酶活性降低可能导致ATP从菌体中溢出，抑制其呼吸代谢。POD与CAT是生物体内的重要保护酶，能清除体内氧化自由基[25-26]。而SDH和MDH是三羧酸循环过程中的重要酶体系。SDH能催化琥珀酸生成延胡索酸，同时能将FAD转化为FADH2；MDH能催化苹果酸生成草酰乙酸，同时能将NAD＋转化为NADH，而FADH2和NADH是呼吸链上的电子供体[27]。ε-PL抑制了菌体中的SDH和MDH活力，表明ε-PL可能阻止腐生葡萄球菌的信息与能量转移。两种酶能为细胞提供辅助因子和能量，其活性降低可能会阻碍碳水化合物的合成与细胞生长，甚至导致其死亡。

以上分析表明，含有阳离子残基的ε-PL通过静电作用吸引到带有负电荷的细菌表面，当ε-PL达到一定浓度时，细胞磷脂膜结构发生变化，渗透性增强，细胞膜上形成孔洞，然后ε-PL通过膜上孔洞进入细胞，破坏微生物的正常生理代谢，引起细胞的物质、能量以及信息传递中断，并与细胞的内部物质发生作用，破坏细胞的核心，造成紫外吸收物的渗出，最终导致细胞死亡。

3 结 论

本实验通过MIC、细菌生长曲线、电导率、紫外吸收变化、AKP与ATP酶活力测定，结合扫描电子显微镜观察，分析ε-PL对腐生葡萄球菌的作用机制。结果表明，ε-PL对腐生葡萄球菌的MIC为1.0 mg/mL，其能使细菌生长速率减缓，细胞壁与细胞膜通透性和完整性受损，内容物外泄，最终使菌体死亡。同时，ε-PL对腐生葡萄球菌三羧酸循环过程中的琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶抑制作用明显，直接影响细胞电子传递链与呼吸作用，抑制其代谢活力，导致菌体死亡。ε-PL进入细胞内，抑制细胞膜上的ATP酶活力，导致细胞内多种代谢途径受阻，同时影响细胞膜的稳定性和多种酶的反应活性。后续研究可考虑在DNA分子水平或结合蛋白组学进一步探究ε-PL的抑菌机制。