壳聚糖-茶多酚复合物对冷藏南美白对虾的微生物区系与品质的影响

甘 晖，米 强，韦恺丽，杨明伟，卢小花，陈世富，吕 敏,*，马华威,*

（1.广西水产畜牧学校，广西 南宁 530031；2.广西水产科学研究院，广西 南宁 530021）

南美白对虾（Penaeus vannamei），又名凡纳对虾，是世界及我国重要经济海水虾类，由于肌肉水分和蛋白质量分数分别高达74%和20%，保鲜不当会导致其在加工、贮藏、销售和流通过程中极易引起微生物繁殖和体内自溶，造成腐败变质，产生异味和肉质恶化[1-2]。微生物生长和代谢是虾类加工过程中造成腐败变质的主要原因，主要在虾体表面和肠道繁殖[3]。致腐微生物区系的改变能引起了虾类腐败形态和化学性质变化，特别是优势腐败菌繁殖所产生的代谢物能造成虾类体内大分子破坏和肌肉自溶，导致组织失去弹性和产生异味[4]。

新一代测序技术不断应用为深入研究水产品贮藏过程的微生物区系提供了基础。当前，利用传统培养方法培养的食品腐败菌占总菌群的比例小，不足以揭示导致食品腐败的总菌群，而高通量测序的独特优势能实现这一目标，筛选出更多腐败菌类，为研究食品微生物区系提供技术支撑[5]。16S rRNA高通量测序是当前研究食品腐败或食品发酵的常用方法，可获得易于分析的数千个序列，能快速、可靠地识别数量较多的食品微生物[6-7]。研究和分析微生物区系在时间轴演变规律是研究食品微生态学的首要任务，为研究与食品贮存条件相关的腐败菌群及抑制食品腐败变质提供有价值的信息[8-10]。因此，研究虾类贮藏过程中微生物区系，分析其腐败菌群演变规律，有针对性地实施有效保鲜技术，对品质控制具有重要研究价值。

天然生物保鲜剂是指提取于生物机体并可用于食品的绿色安全防腐剂，如溶菌酶、茶多酚、壳聚糖、Nisin、蓝莓叶多酚、金针菇提取物等，能够起到杀菌抑菌作用，保证产品品质[11-13]。壳聚糖具有广谱抗菌性，能选择性螯合微生物关键生长因子（如金属离子等），从而抑制微生物生长，抗菌效果好，广泛应用于食品保鲜[14-16]。茶多酚是食品保鲜常用天然活性物，抗菌活性高，且对人体有保健功能[17-20]。这两种天然生物保鲜剂已经广泛应用于水产品贮藏保鲜，并且研究表明选择合适剂量制备而成的复合保鲜剂，抑菌效果更强[21-22]。关于壳聚糖-茶多酚复合物对南美白对虾微生物区系演变和与微生物区系变化所产生的相关化学变化的影响报道很少。因此，本实验参考前人配制壳聚糖-茶多酚复合物的基础上，通过配制复合复合物（3 g/100 mL壳聚糖＋3 g/100 mL茶多酚），同时，用3 g/100 mL壳聚糖、3 g/100 mL茶多酚和无菌水分别处理南美白对虾后于0 ℃冷藏8 d，采用16S rRNA illumina-MiSeq高通量测序研究冷藏过程中南美白对虾微生物学区系在时间轴演变规律，分析感官指标、总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、ATP复合物、K值、生物胺和菌落总数（total viable count，TVC）变化，以期为南美白对虾冷藏中的质量控制提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活南美白对虾由广西鲜之益水产股份有限公司提供，平均体长为（9.37±0.63）cm，平均体质量为（8.37±1.23）g。

茶多酚、壳聚糖（生化试剂） 北京博奥拓达科技有限公司；EX1800琼脂糖凝胶（纯度99%） 北京金克隆生物技术有限公司；ATP复合物 美国Sigma公司；AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒 美国Axygen生物科学公司；QuantiFluor™-ST微型荧光剂 美国Promega公司。

1.2 仪器与设备

1100 高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Mastercycler X50梯度聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 Eppendorf中国有限公司；MiSeq测序仪 美国Illumina公司；2016AB01型数显pH计广西小研人生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料预处理

制备无菌水（CG）、3 g/100 mL茶多酚（TP）、3 g/100 mL壳聚糖（CH）、复合试剂（3 g/100 mL壳聚糖＋3 g/100 mL茶多酚）（CP）。鲜活南美白对虾加氧保活送至实验室，淘汰死虾。制备冰水浆（冰水料液比为3∶1），冰水浆猝死后浸泡30 min，清洗去污，随机均匀分为4 组，每组50 只虾，即无菌水（对照）、茶多酚、壳聚糖、复合处理组。每组虾样品分别在对应处理组和对照组按2∶1（m/V）的比例浸泡10 min，随后将4 组虾样品从溶液中取出，分别用聚氯乙烯袋包装后冰箱0 ℃冷藏，随机在0、2、4、5、6、7、8 d选取样品进行指标测定。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 感官评价

本实验由9 名有经验的感官评定人员（6 名男性和3 名女性）组成感官评定小组，评估冷藏过程虾颜色、气味、质地、可接受性。本实验采用Amerine等感官保质期9 分制评分标准[23]，4 种指标满分均是9 分，每组样品采样后，按照颜色、气味、质地、可接受性进行单项评分，得分为9表示品质优，4.0～6.9表示品质良好，1.0～3.9表示虾腐败。

1.3.2.2 TVB-N含量、TVC和pH值测定

用半微量水蒸气蒸馏法测定TVB-N含量[24]，将5 g虾肉和50 mL蒸馏水倒入匀浆机，匀浆破碎30 min获得混合液体，混合液在1 600 r/min离心3 min后收集上清液，以凯氏定氮仪测定其中的氮含量，并以此表示TVB-N含量，单位为mg/100 g。

采用Hong Hui等[25]的方法测定TVC，取5 g肉样品，加入50 mL无菌0.9 g/100 mL NaCl溶液，匀质器均化30 s，以0.9 g/100 mL NaCl溶液再次稀释10 倍，取100 μL稀释样品均匀涂抹平板计数琼脂上，30 ℃下孵化72 h后计数，以lg（CFU/g）表示。

取5 g虾肉经匀浆破碎虾肉于锥形瓶中，加入45 mL无菌蒸馏水，静置30 min过滤，用数显pH计测定pH值。

1.3.2.3 ATP复合物和K值测定

采用Huang Zhan等[26]的方法提取三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、次黄嘌呤核苷酸（inosine 5’-monophosphate，IMP）、肌苷（hypoxanthine riboside，HxR）、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）。取虾肉1 g，加入2 mL、体积分数10%高氯酸（perchloric acid，PCA）溶液在匀浆机进行匀浆，4 ℃下5 000 r/min离心3 min后收集上清液，沉淀物再重复上述操作。所有上清液pH值用1、10 mol/L氢氧化钾溶液调整至6.5，4 ℃下5 000 r/min离心3 min，随后上清液用PCA溶液（0.6 mmol/L，pH 6.4，下同）定容至10 mL，-20 ℃保存。采用高效液相色谱仪（内置SPD-10A检测器和COSMOSIL 5C18-PAQ柱（4.6 mm I.D.×250 mm）分析ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx含量，K值按下式计算。

式中：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx表示相应物质的含量/（μmol/g）。

1.3.2.4 生物胺含量测定

按照Jia Shiliang等[27]的高效液相色谱法测定生物胺含量，分析冷藏过程中其含量变化。取5 g虾肉，与50 mL蒸馏水匀浆混合，加入10 mL PCA溶液，10 000 r/min离心10 min，重复离心2 次，收集所有上清液，用PCA溶液定容至25 mL。

1.3.2.5 Illumina-MiSeq技术分析微生物区系组成

参考Liu Xiaochang等[7]的方法提取细菌DNA，用PCR方法扩增了16S rRNA基因的V3～V4区，PCR条件：95 ℃变性3 min；95 ℃退火30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循环27 次；72 ℃延伸10 min。引物为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3′）。用质量分数2%琼脂糖凝胶提取扩增产物后，AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒进行纯化，QuantiFluor™-ST微型荧光剂定量分析DNA含量。然后，等物质的量样品利用Illumina-MiSeq配对测序（2×300 bp），初始读数导入NCBI序列读取存档（SRA）数据库，利用QIIME（version 1.17）对初始fastq文件进行多路分解和质量过滤。随后用UPARSE（version 7.1）（http://drive5.com/uparse/）以97%的相似性进行聚类分析可操作分类单位（operational taxonomic units，OTUs），再采用UCHIME识别和删除嵌合序列，基于Silva（SSU115），置信阈值设为70%，用RDP分类器（http://rdp.cme.msu.edu/）对每个16S rRNA基因序列进行分类。最后采用Unifrac距离加权法进行主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA），研究菌群差异。

1.4 数据统计分析

所有实验平行3 次，数据以平均值±标准差表示，利用采用Origin 9.0软件进行实验数据分析和作图，采用单因素方差分析和Duncan’s多组极差法检验差异性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 冷藏过程中南美白对虾感官评价结果

表1 冷藏过程中南美白对虾感官评分Table 1 Sensory scores of Penaeus vannamei during refrigerated storage

如表1所示，随贮藏时间的延长，所有样品感官评分均显著下降（P＜0.05）。第2天，复合、茶多酚、壳聚糖处理组颜色、气味、质地、可接受性评分显著高于无菌水处理组（P＜0.05），复合处理组在颜色、质地、可接受性方面评分显著高于茶多酚、壳聚糖处理组（P＜0.05），而复合、茶多酚、壳聚糖处理组在气味上无显著差异。在第7天，复合处理组的气味评分显著高于茶多酚、壳聚糖处理组（P＜0.05）。无菌水、茶多酚、壳聚糖、复合处理组的感官评价货架期分别是5、7、7、8 d。

2.2 冷藏过程中南美白对虾TVC变化

图1 冷藏过程中南美白对虾TVC变化Fig.1 Changes in TVC of Penaeus vannamei during refrigerated storage

如图1所示，无菌水、茶多酚、壳聚糖、复合处理组的初始TVC分别为4.24、4.11、4.13、4.05（lg（CFUg）），随着冷藏时间延长，各组TVC呈增加趋势。第2天，复合处理组的TVC显著低于无菌水、茶多酚、壳聚糖处理组（P＜0.05），而茶多酚、壳聚糖、无菌水处理组之间没有显著差异，至第4天，茶多酚、壳聚糖处理组显著低于无菌水处理组（P＜0.05）。在无菌水、茶多酚、壳聚糖、复合处理组贮藏的第5、7、7、8天（货架期结束时），TVC分别为5.07、4.26、4.24、3.93（lg（CFUg）），且复合处理组比无菌水、茶多酚、壳聚糖处理组分别减少1.14、0.33、0.31（lg（CFUg））。

2.3 冷藏过程中南美白对虾微生物区系分析结果

图2 冷藏过程中南美白对虾菌群相对丰度（A）和主坐标分析（B）Fig.2 Relative abundance of bacteria (A) and principal co-ordinates analysis (PCoA) (B) of microbiota in Penaeus vannamei during refrigerated storage

菌群相对丰富度如图2A所示，无菌水（5 d）、茶多酚（7 d）、壳聚糖（7 d）、复合（8 d）处理组主要受到19 类细菌属污染。在第0天，各组的优势腐败菌丰度差异不大，主要是弧菌属（Vibrio）、发光杆菌属（Photobacterium）和拟杆状假丝酵母属（CandidatusBacilloplasma），分别占总菌群的41.7%～48.2%、8.97%～11.1%和5.7%～2.2%。在保质期结束时，复合（CP8）、无菌水（CG5）、茶多酚（TP7）和壳聚糖（CH7）处理组的Photobacterium和Vibrio相对丰度均较低，其在复合处理组的相对丰度分别为0.3%和0.2%，在茶多酚处理组分别为0.6%和0.5%，在壳聚糖处理组分别为0.5%和0.5%，在无菌水处理组分别为0.7%和0.8%，CG5的优势菌是假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、CandidatusBacilloplasma和假单胞菌属（Psychromonas），分别占总菌群41.3%、17.2%和17.1%，CP8的优势菌为CandidatusBacilloplasma（17.8%）、变性菌属（Aliivibrio）（17.6%）、Pseudoalteromonas（27.7%）和Psychromonas（19.1%）。TP7和CH7的优势菌均是Aliivibrio、嗜冷菌属（Moritella）和Pseudoalteromonas，分别占总菌群61.9%和61.1%、11.4%和11.8%、19.8%和19.4%。CandidatusBacilloplasma在TP7和CH7组中的相对丰度分别为3.4%和3.5%。

图2B所示为微生物区系组成相似性和差异性。本实验基于PCoA的β-多样性分析，利用加权unifrac距离法描述所有样品的PCoA相似性，距离越大表示相似性差。结果发现，复合、无菌水、茶多酚和壳聚糖处理组在初始贮藏（0 d）的微生物区系组成相似性相对高。与初始贮藏0 d相比，各处理组在货架期终点时的微生物区系组成完全改变。

2.4 冷藏过程中南美白对虾TVB-N含量的变化

图3 冷藏过程中南美白对虾TVB-N含量的变化Fig.3 Changes in TVB-N content of Penaeus vannamei during refrigerated storage

由图3可知，所有样品组的TVB-N含量在冷藏期间不断增加，无菌水、茶多酚、壳聚糖和复合处理组的初始TVB-N含量差别不大，分别为5.12、4.83、4.91、4.76 mg/100 g，自第2天起，复合处理组的TVB-N含量整体上显著低于其他处理组，自第4天起，茶多酚、壳聚糖和复合处理组的TVB-N含量显著低于无菌水处理组（P＜0.05）。

2.5 冷藏过程中南美白对虾pH值变化

图4 冷藏过程中南美白对虾pH值变化Fig.4 Changes in pH of Penaeus vannamei during refrigerated storage

如图4所示，各样品组在冷藏期间的pH值趋于碱性，无菌水、茶多酚、壳聚糖和复合处理组的初始pH值无显著差异，分别是6.79、6.81、6.82和6.81，自第2天起，复合处理组的pH值显著低于茶多酚、壳聚糖和无菌水组（P＜0.05），而茶多酚、壳聚糖处理组自第5天起，显著低于无菌水组（P＜0.05），但壳聚糖、茶多酚处理组之间无显著差异。

2.6 冷藏过程中南美白对虾ATP化合物降解变化

图5 冷藏过程中南美白对虾IMP（A）、HxR（B）、Hx（C）和K值（D）变化Fig.5 Changes in IMP (A), HxR (B), Hx (C), K value (D) of Penaeus vannamei during refrigerated storage

由图5可知，随着冷藏时间延长，整体上所有样品组IMP和HxR含量先增加后减少，K值和Hx含量不断增加。其中，无菌水、茶多酚和壳聚糖处理组的IMP含量最大值位于第4天，而复合处理组位于第5天，无菌水、茶多酚、壳聚糖和复合处理组的最大值分别为5.25、5.21、5.23 μmol/g和4.11 μmol/g；自第5天开始，茶多酚、壳聚糖和复合处理组的IMP含量显著高于无菌水处理组（P＜0.05），从第6天起，复合处理组的IMP含量显著高于其他处理组（P＜0.05），说明复合处理更能抑制IMP降解。随着冷藏时间延长，IMP转变成HxR和Hx，各样品组的HxR含量在贮藏的前4 d没有显著差异，无菌水处理组的HxR含量在第5天达到最大值（1.63 μmol/g），而茶多酚、壳聚糖和复合处理组在第6天达到最大值，分别是1.91、1.88、2.55 μmol/g，且6 d后复合处理组HxR含量显著高于其他处理组。从第4天开始，复合处理组的Hx含量显著低于茶多酚、壳聚糖和无菌水处理组（P＜0.05），K值显著高于其他处理组（P＜0.05）。

2.7 冷藏过程中南美白对虾腐胺和尸胺含量变化

表2 冷藏过程中南美白对虾生物胺含量变化Table 2 Changes in biogenic amine contents of Penaeus vannamei during refrigerated storage

如表2所示，各处理组腐胺含量随冷藏时间延长而不断增加。自第2天起，复合处理组的腐胺均含量显著低于无菌水、茶多酚、壳聚糖处理组（P＜0.05），第5天，无菌水、茶多酚、壳聚糖、复合处理组的腐胺含量分别为2.11、1.36、1.29、0.99 mg/kg，在第8天分别高达7.27、3.46、3.51、2.36 mg/kg。所有样品在第0天未检测出尸胺，第2、4天，复合、茶多酚、壳聚糖处理组的尸胺含量均显著低于无菌水处理组（P＜0.05），而复合、茶多酚、壳聚糖处理组之间无显著差异，第5、8天，复合处理组的尸胺含量显著最低（P＜0.05），无菌水、茶多酚、壳聚糖、复合处理组在第5天的尸胺含量分别为5.66、1.78、1.75、1.10 mg/kg。

3 讨 论

食品腐败主要是腐败菌滋生造成食品品质下降，主要是颜色、气味、质地、可接受性下降。无菌水处理组南美白对虾的TVC在第5天为5.07（lg（CFUg）），与Jia Shiliang[28]、刘金昉[29]等的研究结果相似。无菌水、茶多酚、壳聚糖和复合处理组的感官评价货架期分别为5、7、7 d和8 d，复合处理组的TVC比无菌水、茶多酚、壳聚糖处理组分别减少1.14、0.33、0.31（lg（CFUg））。Cai Luyun等[6]研究发现，贮藏8 d后，3%壳聚糖＋2.5%茶多酚配制的复合物能使鲈鱼贮藏8 d后的Lateolabrax japonicas总量比空白对照组减少1.35（lg（CFUg））。Liu Xiaochang等采用2.5%壳聚糖＋3.0%茶多酚配制成的复合保鲜剂处理鳙鱼Aristichthys nobilis，8 d后其TVC比空白对照组减少1.27（lg（CFUg））[7]。这些结果表明复合处理具有显著抑菌保鲜效果。

食品腐败主要由微生物繁殖生长所造成，微生物区系的变化导致食品变质模式与化学性质发生变化[6]。本研究结果发现，4 个处理在初始贮藏时间（0 d）的优势腐败菌是Vibrio、Photobacterium和CandidatusBacilloplasma，其中Vibrio相对丰度最高，可能是因为一些Vibrio属常出现于水中[27]，在出水时被水产品携带。Photobacterium属于革兰氏阴性菌弧菌科，适合在冷温环境中繁殖生长，与海产品腐败有关[2,6]。Dalgaard等[30]研究发现Photobacterium是气调包装鳕鱼片的优势腐败菌，应用茶多酚、壳聚糖等有效保鲜剂能抑制Photobacterium生长，延长鳕鱼片感官保质期。Photobacterium也是挪威龙虾Nephrops norvegicus的主要腐败菌，在贮藏过程中可将三甲胺还原为三甲，并产生H2S，造成异味[31]。有研究发现，冷鲜鲑鱼Salmo salar上Photobacterium繁殖生长最快，冷藏期能产生胺类和异味[32]。Photobacterium是虾类水产品形成腐胺和尸胺的主要因素，在虾类消化腺内繁殖引起腐败，所产生的挥发性物质和胺类扩散至体表[33-34]，这可能是导致无菌水处理组的虾样在短冷藏时间出现异味的原因。本实验发现，复合处理组的虾样品的腐胺和尸胺含量增加最慢，可能是由于而复合处理组贮藏8 d的Photobacterium丰度相当于无菌水、壳聚糖、茶多酚处理组分别贮藏5、7、7 d的水平（图2A），推测可能复合处理使该菌生长受到抑制导致两种胺类生成较慢，但是具体原因需要进一步研究。本研究中，CandidatusBacilloplasma在所有样品组冷藏期间内均存在，南美白对虾（P.vannamei）[6]、七鳃鳗（Lampetra morii）[35]和中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）[36]在0 ℃冷藏下也发现类似结果，可能该菌在0 ℃条件下的生存能力较强。本研究发现，CandidatusBacilloplasma的生长受茶多酚、壳聚糖处理抑制，而复合处理不能抑制该菌生长繁殖，具体原因需要进一步研究。

本研究发现，无菌水处理组贮藏5 d时的优势腐败菌是Pseudoalteromonas，其次是CandidatusBacilloplasma和Psychromonas。Pseudoalteromonas能够产生与水产品腐败密切相关的TMA、H2S、氨和乙酸等有害物质[37]。Broekaert[37]和Tirloni[38]等证实了Pseudoalteromonas是引起虾褐变的主要优势腐败菌，通过降解虾肉脂质，水解氨基酸与蛋白质，导致虾腐败。Paarup等[34]研究发现，鱿鱼（Todaropsis eblanae）在0 ℃冷藏期间，Pseudoalteromonas数量最多。Iijima等[39]报道，Pseudoalteromonas在食品贮藏过程中通过形成较厚的生物膜并产生胞外蛋白酶引起食品变质。同时，Pseudoalteromonas根据环境变化产生各种胞外化合物，进而用于调节对食物基质适应性以适应变化，最终大量繁殖生长，成为主要优势腐败菌[40]。本研究中复合处理组贮藏8 d后的Pseudoalteromonas丰度高于初始时，可能是茶多酚、壳聚糖和精油不能抑制该菌生长。一些腐败菌CandidatusBacilloplasma由于难以在培养过程中存活，其对水产品的致腐作用研究较少[41]。如本研究初始贮藏时4 个处理组之间的CandidatusBacilloplasma、Leucothrix、Winogradskyella的相对丰度均存在较大差异，说明初始值统计不稳定。国际食品微生物标准委员会[42]提出水产品变质的TVC阈值是7.0（lg（CFUg））。本研究中，无菌水处理组在货架期结束时的TVC仅为5.07（lg（CFUg）），大大低于阈值，可能由于上述3 类菌难以培养造成实际统计的TVC较低。Psychromonas是嗜冷性高盐菌属，广泛分布在水生环境，是深海和极地微生物区系的重要组成部分[3]。研究美国龙虾Homarus americanus在0 ℃冷藏过程腐败变质发现，Psychromonas具有分解脂质和蛋白质能力，且脂质分解能力强[43]。Chen Huibin等[44]研究发现，Psychromonas是牡蛎（Crassostrea gigas和Crassostrea virginica）在4 ℃贮藏中的主要优势腐败菌。本研究中，相比初始贮藏时间，8 d后，CandidatusBacilloplasma、Pseudoalteromonas和Psychromonas未被复合处理抑制，Vibrio和Photobacterium被抑制，复合处理组对优势腐败菌的抑制机制需要进一步研究。

复合、茶多酚和壳聚糖处理组对微生物区系的影响导致了虾类腐败模式及过程的变化，最终可通过生化指标反映出来。TVB-N产生于蛋白质被分解成碱性含氮化合物，如微生物和酶作用下蛋白质分解成氨、二甲胺和三甲胺[26]。这些物质的含量是评价海鲜品质的重要生化指标。本研究发现，各样品组的初始TVB-N含量为7.88～8.01 mg/100 g，与Okpala[45]和Jia Shiliang[24]等的研究结果一致。无菌水处理组的TVB-N含量在0～5 d增加缓慢，之后迅速升高。自第4天起，茶多酚、壳聚糖和复合处理组的TVB-N含量显著低于无菌水组，复合处理组的TVB-N含量从第6天后显著低于茶多酚和壳聚糖组。Gonçalves等[46]报道称TVB-N含量为20 mg/100 g是水产品新鲜度的限含量。本实验中，仅无菌水处理组样品的TVB-N含量在第6天超过限含量，说明茶多酚、壳聚糖和复合处理能显著抑制TVB-N含量增加，且复合处理作用最好。

各样品组的初始pH值为6.88～6.91，与黑虎虾Penaeus monodon结果一致[47]。各样品组的pH值在冷藏期间不断增加，自第2天起，无菌水处理组的pH值显著低于无菌水、茶多酚、壳聚糖组。Varlik等[48]认为新鲜虾类的pH值范围为7.0～8.0。Mehmet等[49]研究发现，当pH值不超过7.7时虾保持良好品质。水产品的pH值上升较小与冷藏过程中样品的微生物增长较低有关[28]。水产品在贮藏过程中pH值的增加主要是由于蛋白质和其他含氮物质在微生物和内源酶的作用下分解成挥发性碱，如胺和三甲胺[50]。

鱼虾类死亡后的ATP降解途径为：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，ATP向IMP的转化被认为是一个完全自溶的过程[28]。本研究中，茶多酚、壳聚糖和复合处理能抑制虾的IMP进一步降解，使虾保持较好口感。在自溶酶和细菌酶作用下，IMP转化为HxR和Hx，Hx的积累导致良好口感逐渐消失，产生苦味[28]。研究发现，贮藏前2 d所有样品组的Hx含量无显著差异，自第4天开始复合处理组的Hx含量显著低于其他处理组，而自第6天起茶多酚、壳聚糖、复合处理组的HxR高于无菌水处理组，这可能是由于茶多酚、壳聚糖和复合处理改变了虾样品中微生物区系，抑制了HxR降解为Hx，与Hernández-Cázares等[51]也认为Hx的形成与腐败菌产生的核苷磷酸化酶有关的观点一致。

生物胺是一种非挥发性的低分子量含氮化合物，主要由细菌通过游离氨基酸脱羧而形成，海产品中最常见的生物胺是腐胺和尸胺[28]。腐胺含量是指示虾类在不同温度贮藏下肌肉蛋白质降解程度的最佳指标，尸胺的产生与腐胺有类似规律[52]。本研究在P.vannamei中发现了与腐败相关的腐胺和尸胺，自第2天起复合处理组的腐胺含量均显著低于无菌水、茶多酚、壳聚糖处理组。Lakshmanan等[33]发现在冷藏条件下存活的Photobacterium可能与鱼虾类的腐胺和尸胺形成有关。本研究发现，冷藏过程中P.vannamei产生腐胺和尸胺被茶多酚、壳聚糖和复合处理抑制，可能因为茶多酚和壳聚糖能直接修饰脱羧酶或在冷藏期间抑制腐败菌Photobacterium。有研究表明，茶多酚和壳聚糖能通过静电或疏水相互作用与某些蛋白质、核酸结合，进而抑制微生物的生理功能[53]。茶多酚和壳聚糖作为一种可逆抑制剂可抑制脂肪酶活性，其抑制能力随聚合度的增加而增大[28]。生物胺是氨基酸被多种氨基酸脱羧酶脱羧产生，筛选脱羧酶抑制剂对于抑制由水产品腐败所产生的生物胺具有重要意义[33]。然而，关于茶多酚和壳聚糖联合使用是否能影响脱羧酶的活性，以及茶多酚和壳聚糖能影响哪种脱羧酶活性的研究较少。因此，需要进一步解决这些问题。

感官评分是反映虾贮藏过程中最重要的品质指标之一。食品腐败由细菌大量繁殖生长所产生的代谢产物引起[28]，具体表现为变色、理化性质劣变、结构破坏、黏液和形成异味，从而导致感官评分下降。本研究中，随着冷藏时间延长，各样品组的颜色、气味、质地和可接受性的感官评分均显著降低。第5天，无菌水处理组不能被感官评价小组接受食用。Pseudoalteromonas是无菌水处理组样品腐败的核心菌属，能产生大量的硫化物和丙酮，可水解蛋白质，导致质地劣化[37]。本研究中，在冷藏第2天复合、茶多酚和壳聚糖处理组气味、颜色和质地评分显著高于无菌水处理组，这可能是由于壳聚糖和茶多酚抑制了Pseudoalteromonas的生长繁殖。虾肌肉的质地软化也与组织蛋白酶B或L、组织蛋白酶D、碱性蛋白酶和钙依赖蛋白酶等内源性蛋白酶引起的蛋白质水解有关[54]。因此，壳聚糖和茶多酚对内源性蛋白酶的影响也有待进一步研究。无菌水处理组颜色得分偏低的另一个原因是多酚氧化酶介导了酶促褐变形成的黑变[37]。本研究发现，复合处理组黑变程度较低，壳聚糖和茶多酚协同抑制黑变机制需要进一步研究，比如黑变率低是否与两者协同对虾类微生物的修饰作用或对多酚氧化酶的抑制作用有关。总地来讲，在冷藏过程中，复合处理组的感官质量更优，感官保质期较长。

4 结 论

本研究发现，无菌水、茶多酚、壳聚糖和复合处理组的感官保质期分别为5、7、7 d和8 d。自第2天起，复合处理组的TVC、TVB-N含量、pH值、腐胺含量均显著低于无菌水、茶多酚和壳聚糖处理组（P＜0.05），并且抑制IMP化合物降解效果最好。在贮藏0 d时，各组的优势腐败菌是Vibrio、Photobacterium和CandidatusBacilloplasma，而随着贮藏时间延长，保质期结束时，优势腐败菌区系发生明显改变。通过对各样品组的南美白对虾对比分析，结果发现复合保鲜组的南美白对虾品质最佳，感官保质期最长。南美白对虾在0 ℃冷藏过程中的优势腐败菌引起品质变化的潜在机制和复合保鲜组抑菌机理需进一步深入研究。