环境微生物学教材中微生物分类鉴定教学内容更新的思考

张婷娣 刘 南 任何军

（吉林大学新能源与环境学院 吉林·长春 130021）

环境微生物学是微生物学与环境领域相结合的新兴综合学科，是环境科学与工程相关专业的必修基础课。环境微生物学是以微生物学的理论与技术为基础，对一些环境现象、环境质量以及环境问题进行研究，主要包括自然环境中微生物的生长繁殖、种类分布、结构功能和污染环境中微生物的功能等内容。

目前国内高校使用的环境微生物学教材主要有以下版本：

（1）乐毅全和王士芬主编的《环境微生物学》（化学工业出版社，第三版，2019）；

（2）郑平编著的《环境微生物学》（国家精品课程配套教材，浙江大学出版社，第二版，2020）；

（3）徐威等主编的《环境微生物学》（中国建材工业出版社，2017）；

（4）任何军和张婷娣主编的《环境微生物学》（清华大学出版社，2015）。

与环境微生物学课程相关的其它重要教材主要有：周德庆编著的《微生物学教程》（高等教育出版社，第四版，2020）；沈萍和陈向东主编的《微生物学》（高等教育出版社，第八版，2016）；周群英和王士芬编著的《环境工程微生物学》（高等教育出版社，第四版，2015）；林海主编的《环境工程微生物学》（冶金工业出版社，第二版，2014）；王国惠主编的《环境工程微生物学——原理与应用》（化学工业出版社，第三版，2015）；Willey等编写的英文原版教材《Prescott’s Microbiology》（MC Graw Hill Education出版社，第十版，2017）。《微生物学》教材侧重微生物基本理论知识，《环境工程微生物学》教材侧重微生物在环境领域的应用，而《环境微生物学》教材则介于《微生物学》和《环境工程微生物学》之间，相关中文教材的基本框架主要分为两部分：第一部分是基础微生物学内容，主要包括微生物学及显微镜的发展史、微生物的分类与鉴定、微生物的形态结构与功能、微生物的培养、微生物的生长繁殖与代谢、微生物的遗传变异和育种、微生物的生态；第二部分是环境应用微生物部分，主要包括环境中微生物的分布与检测、微生物对污染物的降解与转化、水污染控制微生物、固体废物处理微生物、环境生物技术等。本论文仅以这些教材为代表，结合微生物学发展史以及现代生命科学的先进研究方法来分析微生物的分类鉴定教学内容。

微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。由于微生物形体微小，无法肉眼观察，导致长期以来人类对微生物表现出“视而不见，嗅而不闻，触而不觉，食而不察，得其益而不感其恩，受其害而不知其恶”的状态。直到1676年，荷兰人安东尼·列文虎克（AntonivanLeeuwenhoek，1632-1723）用其自制的简易显微镜观察到了微生物并记录它们的形态大小，人类开始进入微生物世界的大门。在此初创时期，微生物的分类鉴定主要是形态描述。后来法国科学家路易·巴斯德（Louis Pasteur,182-1895）和德国医生罗伯特·科赫（Robert Koch,1843-1910）各自完成了许多与微生物相关的工作，创立了一整套独特的微生物学基本研究方法，是微生物学这一学科的主要奠基人。这一时期主要从个体形态（形态大小、排列方式、芽孢、运动性、染色反应等）、群体形态（菌落形态、半固体或液体培养基中的生长状态）、生理生化反应（营养要求、生长条件、产酶种类、代谢产物、药物敏感性）、生活史、致病性等方面对微生物进行分类鉴定。19世纪30年代研发出了电子显微镜，从而可以观察到病毒的形态结构和细菌细胞的亚细胞结构。以上指标是微生物分类鉴定的经典指标，一直沿用至今。若用这些经典指标方法对未知纯培养物进行鉴定，不仅工作量浩大，还容易出现错误。

为了简化微生物分类鉴定的步骤，提高鉴定结果的准确性，很多公司在21世纪初推出了基于部分经典指标（主要是生理生化反应指标）的自动化鉴定技术，比如“API”系统、“Enterotube”系统和“Biolog”系统等。将纯种微生物按照系统要求培养后，根据代谢特征与数据库中的微生物比对，以初步进行分类鉴定。如果该未知纯种微生物的代谢特征与数据库中所有微生物都不一致，则无法对其进行分类鉴定。沃森（J.Watson）和克里克（F.Crick）于1953年发现DNA双螺旋结构以来，微生物学快速进入分子生物学时代，因而，大量分子生物学技术被用于微生物的分类鉴定，主要包括GC比值、核酸分子杂交法、16S或18SrRNA鉴定、多位点序列分型、基因指纹图谱等。这些用于微生物分类鉴定的分子生物学方法主要基于微生物基因组中部分DNA序列的同源性来进行鉴定，无法代表微生物基因组的全部特征。目前微生物学相关教材都会对以上微生物分类鉴定内容进行详细介绍，而对于最近发展极为迅速的全基因组测序技术在微生物分类鉴定中的作用则不提及或者仅做少量描述。

全基因组测序是对未知基因组序列的物种进行个体的基因组测序。获得任何一个未知物种的全基因组序列就相当于拿到了该物种的唯一“身份证”，从而可以对其分类鉴定。第一个完整的生物体基因组全序列是英国科学家Frederick Sanger于1977年发表的5386 bp的噬菌体X174全基因组的DNA序列。随后于1990年正式启动了人类基因组计划（Human Genome Project,HGP），并于2003年完成人类基因组精细图。在此期间，完成了大肠杆菌（1997年）和酿酒酵母（1996年）的全基因组序列测定。从那时候至2014年之前，完成了上千种微生物全基因组测序，但是受到测序技术的限制，90%以上的微生物基因组为草图。虽然微生物基因组草图比前面列举的用于微生物分类鉴定的分子生物学方法所比对的碱基数量要多一些，结果也相对可靠一些，但是由于微生物基因组草图并不包括基因组全部序列，所以依然很难对微生物进行准确的分类鉴定。近年来，Pacbio研发出新一代测序技术（也称之为第三代测序技术）可以快速获得纯培养微生物的完成图，并于2014年左右开始全面商业推广，目前已经基本普及。与以前的测序技术相比，该技术简单快速、准确、便宜，且生物信息学分析更加全面系统。截至目前，微生物基因组完成图发表数量急剧上升。因此，可用于微生物分类鉴定的完成图数据也将更加丰富。

微生物分布广、数量多、种类多（除了肉眼可见的后生动物、高等植物等之外，绝大部分生物类群都属于微生物）、杂居混生、易变异，还个体微小，无法肉眼分辨，因此，微生物的分类鉴定工作一直都是微生物研究的重要方向与难题。除了微生物全基因组序列外的其余鉴定方法或多或少会受到培养条件、检测方法、技术人员熟练程度、观测指标等多种因素的影响，很多时候采用不同鉴定方法会将同一微生物归属于不同类群，给微生物分类带来很大的麻烦。而每一株微生物的基因组序列是独一无二的，因此，获得了待鉴定微生物的全基因组序列后，可以对其进行精确分类，通过与基因组序列同源性高的其它已知微生物比较，很快就能获得该菌株的其它性状，比如运动性、营养要求、致病性、生长特性等。随着测序技术的持续发展以及已知微生物全基因组序列数目的飞速增长，不久微生物的全基因组测序分析将有可能会成为微生物分类鉴定的最主要方式。因此，建议微生物学教材体系中补充更新采用全基因组序列鉴定微生物这一部分内容，先简单介绍全基因组测序方法和原理，然后重点介绍微生物基因组组成、全基因组比对分析方法（比如共线性分析、Core-pan基因分析、基因家族分析、ANI分析法），如何利用全基因组序列进行分类鉴定，以及如何获得鉴定后微生物的其它生理生化性状等内容。此部分内容在经典的英文原版教材《Prescott’s Microbiology》（MC Graw Hill Education 出版社，第十版，2017）已经进行了更新。为了与学科的发展前沿技术接轨，因此，建议新编或者改版《环境微生物学》教材时对此部分内容进行更新。微生物的分类鉴定是环境微生物学教学和科研的重要组成部分，此部分内容究竟如何更新，需要更多的同行或者学者从不同角度来思考、探索，以促进学生对该内容的掌握。