NR2F2过表达对三阴性乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响及机制研究*

张艳丽， 常文慧， 赵梓妍， 王文明， 李 菁， 丁 怡△

潍坊医学院 1病理生理学教研室 2应用药理学实验室 3眼科学教研室，潍坊 261053

乳腺癌(breast cancer，BC)是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率和死亡率一直呈现上升趋势[1-3]。其中三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(HER-2)均表达阴性的一种乳腺癌亚型[4]，约占乳腺癌的15%～20%[5]。由于缺乏治疗靶点，三阴性乳腺癌治疗手段较为局限，预后较差[6]。因此探索潜在的分子靶基因对三阴性乳腺癌早期诊断与治疗有十分重大的意义。

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子(The chicken ovalbumin upstream promoter transcriptional factors，COUP-TFs)属于类固醇/甲状腺激素受体超家族[7-9]。由于其配体尚未被发现，所以被形象地称为“孤儿核受体”。在脊椎动物，已经鉴定出2种COUP-TF，分别为COUP-TFⅠ(EAR3)[10-11]和COUP-TFⅡ(ARP-1)[12-13]，也称为核受体2家族1和2(NR2F1和NR2F2)。近年来NR2F2被认为是肿瘤上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程中的重要调控分子，在肿瘤发生及进展中发挥着重要作用，与肿瘤的迁移与侵袭，以及不良的临床预后密切相关[14]。Zhou等[15]发现，NR2F2敲除后，结直肠癌细胞的生长、迁移和侵袭受到抑制，组织病理检测结果显示NR2F2的高表达与结直肠癌患者的不良预后相关。Nagasaki等[16]通过免疫组织化学染色发现，119例乳腺癌患者中59%的人NR2F2免疫组化阳性，且NR2F2的高表达与较差的预后和临床结局以及淋巴结转移相关。因此，我们通过构建NR2F2过表达4T1细胞模型，观察其对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响及其可能的机制，为阐明NR2F2的生物学作用提供依据，为三阴性乳腺癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

乳腺癌细胞用含10%胎牛血清、1%的青链霉素的RPMI培养液，置于37℃ 5% CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞进行后续的各种实验。小鼠乳腺癌细胞4T1细胞株来自中国科学院细胞库，RPMI 1640培养液购于Hyclone公司，青霉素/链霉素购于北京索莱宝生物科技有限公司，胎牛血清为杭州四季青公司产品。

1.2 慢病毒感染

将处于对数生长期的4T1细胞消化后，以(3～5)×103/孔接种于96孔板中，第2天细胞汇合度达到约30%时，按复感染指数(multiplicity of infection，MOI)=10加入NR2F2过表达的慢病毒载体，然后放入培养箱内培养，10 h后更换新鲜培养液，72 h后在荧光显微镜下观察感染的细胞，视野内所有细胞均表达绿色荧光，表示转染病毒已经进入细胞，经过一段时间的培养待其稳定生长后，用5 mg/L的嘌呤霉素进行筛选。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测感染后NR2F2的表达量。慢病毒感染试剂、嘌呤霉素由吉凯基因公司提供，Opti-MEM培养液购自Gibco公司。

1.3 细胞划痕实验

细胞以2×105个/孔接种于提前横向标记好直线的6孔板中，待细胞长到80%～90%，更换为含1%血清的培养液饥饿细胞12 h。之后用200 μL的枪头在每孔中纵向划直线，PBS漂洗以除去划下的细胞。随后加入无血清培养液，培养24 h后于倒置显微镜下观察并拍下0、24 h划痕愈合的照片。采用Image-Pro-Plus 6.0分析过表达NR2F2组细胞与对照组细胞的迁移比例。

1.4 Transwell迁移实验

将细胞经胰酶消化后，用低浓度血清培养液重悬细胞，细胞密度调整至2.0×105/mL，上室加入200 μL细胞悬液，下室加入500 μL含10% FBS的培养液。5% CO2恒温培养箱中孵育24 h后，将下室面穿过的细胞进行固定、染色，显微镜下拍照并计数。采用Image-Pro-Plus 6.0计数两组细胞的穿膜细胞数。Transwell chamber购自索莱宝生物科技有限公司。

1.5 Transwell侵袭实验

将Matrigel基质胶(购自Sigma公司)在冰上融化，在冰上按照基质胶∶无血清培养液=1∶9的比例稀释并混匀。将Transwell小室放入24孔板内，用预冷的枪头取50 μL基质胶稀释液均匀加入小室内(避免气泡的产生)，放入37℃细胞孵育箱过夜固化，使用前加入50 μL无血清培养液水化基底膜30 min。将细胞经胰酶消化后，用低血清培养液重悬细胞，细胞密度调整至2.0×105/mL，上室加入200 μL细胞悬液，下室加入500 μL含10% FBS的培养液。5% CO2恒温培养箱中孵育24 h后，将下室面穿过的细胞进行固定、染色，显微镜下拍照并计数。采用Image-Pro-Plus 6.0计数两组细胞的穿膜细胞数。

1.6 Western blot检测

提取实验细胞蛋白，细胞用RIPA与PMSF混合液裂解，在4℃、12000 r/min离心15 min。收集上清液，用BCA法测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。加入一抗4℃下孵育12 h，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗37℃下反应1 h。使用增强的化学发光试剂ECL发光并在曝光仪上进行曝光。采用Image-Pro-Plus对蛋白条带进行灰度分析，并以目的蛋白与β-actin灰度值的比值反映目的蛋白的相对表达量。NR2F2抗体购自Perseus Proteomics公司，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗体购自CST公司，β-actin抗体购自Proteintech公司。

1.7 实时荧光定量RT-PCR检测

用Trizol法提取细胞总RNA，用分光光度法测定其浓度和纯度。按试剂盒说明书进行逆转录和PCR反应。PCR反应条件为95℃30 s，后续的40个循环为95℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 15 s。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA表达量，以与对照组的比值反映相对表达量。逆转录扩增试剂盒由东洋坊提供。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。E-cadherin：上游5′-GCCACCGATGCAGACGATGAC-3′，下游5′-CAGCCTG-AACCACCAGAGTGTATG-3′，N-cadherin：上游5′-AGGCGTCTGTGGAGGCTTCTG-3′，下游5′-TGCCGTCCTCGTCCACCTTG-3′，Vimentin：上游5′-ACTAGCCGCAGCCTCTATTCCTC-3′，下游5′-GAAGTCCACCGAGTCTTGAAGCAG-3′，NR2F2：上游5′-GTGCCTCAAAGTGGGCATGA-3′，下游5′-ATCCGGACAGGTACGAGTGG-3′。

1.8 统计学分析

用GraphPad Prism 5.0软件制图，用SPSS 22.0进行统计分析，同一实验至少重复3次。各组间均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 稳定过表达NR2F2细胞株的构建

利用体外培养的小鼠三阴性乳腺癌细胞系4T1，通过带有GFP的慢病毒感染，经嘌呤霉素筛选，构建了稳定过表达NR2F2的4T1细胞株(OX-NR2F2-4T1)。荧光显微镜下观察发现，细胞均呈现绿色荧光，与对照细胞(NC-4T1)相比，过表达NR2F2的细胞形态上更细长，呈间质表型特征(图1A)。实时荧光定量RT-PCR检测2种细胞NR2F2 mRNA表达的结果显示，OX-NR2F2-4T1细胞中NR2F2表达为NC-4T1细胞2倍多(图1B)。Western blot检测NR2F2蛋白表达的结果显示，OX-NR2F2-4T1细胞中NR2F2表达明显高于NC-4T1细胞(图1C)，差异有统计学意义(图1D)。这些均提示过表达NR2F2的4T1细胞构建成功。

A：小鼠乳腺癌4T1细胞经慢病毒感染、嘌呤霉素筛选后，荧光倒置显微镜观察细胞形态，过表达NR2F2(OX-NR2F2-4T1)细胞形态学较细长(×100)；B：实时荧光定量PCR检测NR2F2 mRNA的表达，过表达组细胞NR2F2 mRNA表达明显高于对照组(NC-4T1)；C：Western blot检测蛋白表达，过表达组细胞NR2F2蛋白表达明显高于对照组；D：NR2F2蛋白表达结果分析(n=3)；与NC-4T1比较，*P<0.05 图1 构建稳定过表达NR2F2乳腺癌细胞株Fig.1 Construction of a 4T1 cell strain stably over-expressing NR2F2

2.2 NR2F2对乳腺癌细胞迁移能力的影响

我们通过划痕实验、Transwell迁移实验观察了NR2F2对细胞迁移能力的影响。划痕实验结果显示，随着时间的推移，OX-NR2F2-4T1组与NC-4T1组的细胞迁移率的差异增大，至24 h时，OX-NR2F2-4T1组细胞中划痕几乎愈合，而在对照组中划痕仍清晰可见(图2A)，统计学分析显示，差异有统计学意义(图2B)。Transwell迁移实验结果与划痕实验基本一致，即OX-NR2F2-4T1组细胞穿膜细胞数明显多于NC-4T1组(图2C)，统计学分析显示，差异有统计学有意义(图2D)。这提示NR2F2能够增强乳腺癌细胞的迁移能力。

A：划痕实验检测细胞的迁移能力，划痕24 h后，OX-NR2F2-4T1组迁移率比NC-4T1组的迁移率显著增大；B：划痕实验结果的统计分析(n=3)，OX-NR2F2-4T1组迁移率明显高于NC-4T1组；C：Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力，接种24 h后，OX-NR2F2-4T1组穿膜细胞数明显多于NC-4T1组；D：Transwell迁移实验结果的统计分析(n=3)；与NC-4T1组比较，*P<0.05图2 NR2F2对乳腺癌细胞迁移能力的影响Fig.2 Effect of NR2F2 on migration ability of breast cancer cells

2.3 NR2F2对乳腺癌细胞侵袭能力的影响

我们利用Transwell侵袭实验检测NR2F2对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。结果显示，相比NC-4T1组细胞，OX-NR2F2-4T1组的细胞侵袭能力增加(图3A)，统计学分析显示差异有统计学意义(图3B)，提示NR2F2过表达增强了乳腺癌细胞的侵袭能力。

A：将细胞接种预置基质胶的Transwell小室的上室，孵育24 h后，OX-NR2F2-4T1组穿膜细胞数比NC-4T1组明显增加；B：Transwell侵袭实验结果的统计分析(n=3)；与NC-4T1组比较，*P<0.05图3 NR2F2对乳腺癌细胞侵袭能力的影响Fig.3 Effect of NR2F2 on the invasion ability of breast cancer cells

2.4 NR2F2对乳腺癌细胞EMT相关标志物表达的影响

我们运用实时荧光定量PCR和Western blot的方法分别检测了OX-NR2F2-4T1组和NC-4T1组细胞EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin mRNA及其蛋白的表达(图4)。结果显示，过表达NR2F2后，E-cadherin mRNA的表达量降低，而Vimentin、N-cadherin mRNA表达量增加。Western blot的检测结果相似，与NC-4T1组相比，OX-NR2F2-4T1组的E-cadherin的蛋白表达水平降低，而Vimentin、N-cadherin的蛋白表达水平升高(均P<0.05)。这提示NR2F2可以促进乳腺癌EMT，而且可能通过调控EMT相关标志物N-cadherin、Vimentin、E-cadherin的表达来促进乳腺癌细胞迁移和侵袭。

A：采用实时定量PCR检测OX-NR2F2-4T1组和NC-4T1组细胞EMT相关标志物mRNA的表达，OX-NR2F2-4T1组上皮标志物E-cadherin mRNA的表达量降低，而间质标志物Vimentin、N-cadherin mRNA表达量增加；B：Western blot检测OX-NR2F2-4T1组和NC-4T1组细胞EMT相关标志物蛋白的表达，NR2F2过表达后，E-cadherin蛋白水平降低，而Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平升高；C、D、E：EMT相关标志物蛋白表达结果分析(n=3)；与NC-4T1组比较，*P<0.05图4 NR2F2对乳腺癌细胞EMT生物标志物表达的影响Fig.4 Effect of NR2F2 on breast cancer cell EMT biomarkers

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其中以三阴性乳腺癌的恶性程度高，容易发生早期转移，预后也最差[17]。EMT被认为是肿瘤发生转移的起始和关键。EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，期间细胞在形态学上更加细长，迁移侵袭能力增强。在此过程中上皮细胞经历了细胞骨架的重塑，可能会失去促进细胞间接触的蛋白(如E-cadherin和γ-catenin)，细胞间充质分子标志物(如波形蛋白、纤维连接蛋白、N-cadherin、金属蛋白酶MMP-2、MMP-9等)表达上调[18]。越来越多的研究表明，上皮间质转化与肿瘤的发生发展密切相关，而且在恶性肿瘤的迁移侵袭、转移过程中扮演着重要角色。

转录因子NR2F2被证实在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和胰腺癌的发生和发展中发挥重要作用[19-23]。研究表明，多种恶性肿瘤组织高表达NR2F2，且NR2F2的表达水平与肿瘤恶性程度相关[24]。进一步研究认为，NR2F2可能通过影响细胞增殖、血管和淋巴管的生成等影响肿瘤进展。Zheng等[25]发现敲除NR2F2后，细胞增殖受到明显抑制，细胞凋亡增加。Chen等[26]发现NR2F2可以直接与E2F1启动子上的Sp1结合位点结合，直接调控E2F1的表达，进而调控细胞周期。Qin等[19]研究发现，NR2F2可以调控血管生成素信号通路从而调控肿瘤血管的生成。

目前对于NR2F2在肿瘤转移中的机制研究停留在细胞分子水平，需要更多的体内实验结果支持。NR2F2作为一个较为保守的基因，在人和小鼠中具有高度的同源性，利用BALB/c小鼠接种小鼠乳腺癌4T1细胞复制乳腺癌模型是实验室常用的研究方法。已有研究表明，绿色荧光蛋白GFP对4T1细胞的迁移侵袭以及EMT的相关标志物的表达没有影响[27]。因此，在本研究中，我们采用带有绿色荧光GFP和嘌呤霉素抗性的慢病毒为载体，通过感染细胞，嘌呤霉素筛选，得到稳定过表达NR2F2的工具细胞，并开展相关研究。经过荧光显微镜下确认，筛选出的细胞呈现绿色荧光，提示慢病毒感染成功。实时定量RT-PCR和Western blot的检测结果显示，NR2F2 mRNA和蛋白的表达都明显高于对照组，均提示稳定过表达NR2F2的4T1细胞构建成功。

NR2F2促进乳腺癌细胞EMT。显微镜下观察到，与对照组相比，NR2F2过表达细胞形态更加细长，即发生间质表型改变。接下来我们通过划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力，结果发现过表达NR2F2细胞的迁移能力明显增强。Transwell侵袭实验结果也显示，过表达NR2F2后，细胞的侵袭能力增强。以上提示，过表达NR2F2可能促使乳腺癌细胞发生了由上皮表型向间质表型的转换，细胞的迁移、侵袭能力增强。

NR2F2通过调控EMT相关标志物引起EMT。我们对比检测了过表达NR2F2和对照细胞中EMT相关标志物，结果显示，过表达NR2F2的乳腺癌细胞中上皮表型标志物E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平降低，而间质表型标志物N-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表达水平均明显增多，这些也提示细胞发生EMT。近年来越来越多的研究表明，NR2F2参与了EMT的调控，NR2F2可能通过调控EMT上游基因的表达影响EMT相关marker的表达[28]。Bao等[23]通过染色质免疫共沉淀发现，NR2F2可直接靶向Snail1的启动子，调节Snail1及其下游EMT相关基因的表达。Bao等[29]还发现，在结直肠癌中NR2F2可以下调miR34a表达，从而使Vimentin上调，E-cadherin下调，促进了EMT的发生。Xia等[30]发现在乳腺癌细胞中敲除NR2F2可以减弱胰岛素诱导的EMT，使N-cadherin、Vimentin下调，E-cadherin上调。Hao等[31]发现NR2F2在结直肠癌中表达上调，并且可以直接转录激活miR-21，下调Smad7，从而促进了TGF-β诱导的EMT。

综上所述，我们通过慢病毒感染4T1细胞，成功构建了带有绿色荧光的稳定表达NR2F2小鼠三阴性乳腺癌细胞株，并发现，NR2F2通过调控EMT相关标志物的表达，促进乳腺癌细胞发生EMT，细胞迁移、侵袭能力增强，进而可能导致肿瘤转移和与EMT相关化疗药物耐药等。以转录因子NR2F2为靶点的药物研发可能为三阴性乳腺癌患者的临床治疗提供新的思路。