GNAI2高表达在食管鳞癌中的临床意义及预后价值*

王海瑞， 原 翔， 刘怡文， 孙 蔚， 王 甄， 常保萍， 高社干

河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院，河南科技大学肿瘤研究所，河南省肿瘤表观遗传重点实验室，洛阳 471003

食管癌是最常见的胃肠道肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势[1-2]，且每年死亡人数超过40万[3]。食管癌有两个主要的组织学类型，包括食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)，食管腺癌是欧美国家常见的类型，约占70%～80%，但亚洲和非洲国家以食管鳞癌更为多见，在我国，90%左右食管癌为鳞癌[4-6]。食管鳞癌患者在早期可能有诸如消瘦、恶心、体重减轻等不明确的症状，影响早期诊断准确性，致使多数患者就诊时已到晚期或伴有转移，预后极差。当下，虽然对食管鳞癌的发生、发展和治疗等方面的研究已经取得了可观的进展，但是依然没有有效的治疗方法，且存活率较低[7]。研究者们长期致力于寻找影响食管癌发生、发展、转移的重要因子，以期预测其发生、发展、转移及预后的情况。

GNAI2(Guanine nucleotide-binding protein G(i) subunit alpha-2)属于G蛋白家族中的一个抑制型，主要作用是抑制腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，AC)的活性，降低细胞内第二信使环磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)含量，进而产生相应的生物学效应，是一种极其重要的信号传导分子。已有大量研究显示，GNAI2在舌鳞状细胞癌[8]、卵巢癌[9]、前列腺癌[10-11]、结直肠癌[12-13]等肿瘤中的表达与患者的预后密切相关。本研究旨在探讨食管鳞癌及癌旁组织中GNAI2的表达情况及其差异，并分析其与食管鳞癌患者临床病理特征的相关性，以期为食管鳞癌的治疗提供新的思路和靶点。

1 材料与方法

1.1 病例资料

筛选在河南科技大学第一附属医院2012年10月到2013年12月期间行手术切除的食管鳞癌患者，取癌组织及配对癌旁组织(距肿瘤组织边缘>5 cm)完整的石蜡包埋标本。纳入标准：①患者术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗；②治疗性食管鳞癌切除术后；③术后病理明确诊断为食管鳞癌；④病例资料信息全面；⑤中位随访时间为60个月；⑥癌组织及配对癌旁组织标本完整。通过分析和筛选，共50例食管鳞癌患者组织标本被纳为研究对象，其中，男32例，女18例；年龄<60岁14例，≥60岁36例；高分化18例，中分化25例，低分化7例；浸润深度≥外膜36例，<外膜14例；淋巴结转移者25例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期28例，Ⅲ/Ⅳ期22例。50例食管鳞癌患者术后随访时间均为60个月，生存时间为入院时间至最后一次随访日期或死亡日期，删失数据是指随访至60个月仍存活的患者，未删失数据为由食管鳞癌导致的死亡患者。本研究经河南科技大学第一附属医院肿瘤研究所及医院伦理委员会审批，所有患者在参与研究前均知情同意。

1.2 主要试剂与仪器

链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，GNAI2兔抗人单克隆抗体(英国Abcam公司)，柠檬酸抗原修复液(pH6.0)、苏木精、中性树胶、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)均购自北京中杉金桥有限公司，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)(上海碧云天生物技术有限公司)；光学显微镜(日本尼康公司)。

1.3 免疫组织化学法检测食管鳞癌及癌旁组织中GNAI2蛋白表达

设定厚度为3 μm，对选取的石蜡包埋组织标本进行连续切片；置于60℃烤箱中溶蜡1.5 h，趁热放入二甲苯溶液中浸泡脱蜡3次，10 min/次，随后进行乙醇梯度水化，乙醇体积分数分别为100%、95%、90%、85%，每次5 min；将片子放入95℃柠檬酸中抗原修复15 min；PBS冲洗3次，5 min/次；用过氧化物酶阻断剂封闭10 min；PBS冲洗，5 min/次，共3次；山羊血清封闭30 min，消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性、降低背景；切片上滴加50 μL一抗(GNAI2兔抗人单克隆抗体，PBS稀释比1∶200)，4℃过夜；PBS冲洗3次，5 min/次；滴加山羊抗鼠/兔二抗覆盖组织，室温孵育30 min；PBS冲洗，5 min/次，共3次；滴加SP室温封闭10 min；PBS冲洗，5 min/次，共3次；DAB显色10 min；蒸馏水冲洗10 min；苏木精复染10 min，乙醇脱水、常规二甲苯透明，中性树胶封片；在光学显微镜下观察食管鳞癌及癌旁组织中GNAI2蛋白的表达情况。以2名资深病理科医生判定的阳性切片为阳性对照，阴性对照为PBS缓冲液替代一抗做出的阴性切片。阳性染色判定标准：细胞质出现浅黄色、棕黄色或棕褐色着色。染色强度计分：0分(无色至浅黄色)，1分(棕黄色)，2分(棕褐色)，3分(深褐色)；阳性细胞百分比计分：<5%为0分，≥5%且<25%为1分，≥25%且<50%为2分，≥50%且<75%为3分，≥75%为4分；综合评分标准为每个视野染色强度和阳性细胞百分比计分的乘积，0～3分为阴性，4～12分为阳性，最终免疫组织化学评分为随机取5个视野评分的均值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 食管鳞癌及癌旁组织中GNAI2蛋白表达比较

食管鳞癌及癌旁组织中均可见细胞质出现棕黄色颗粒，为GNAI2阳性表达(图1)。癌组织中GNAI2免疫组织化学评分(8.33±1.45)显著高于癌旁组织[(3.17±0.60)，P<0.05]；分化程度越低的组织，免疫组织化学评分越高[图1A高分化：(7.00±0.58)、图1B中分化：(8.00±1.22)、图1C低分化：(11.00±0.58)]。

A：高分化；B：中分化；C：低分化；D：癌旁组织图1 食管鳞癌组织及癌旁组织中GNAI2的表达(免疫组织化学染色，×400)Fig.1 Expression of GNAI2 in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent tissues(immunohistochemical staining，×400)

2.2 GNAI2表达与食管鳞癌患者临床病理特征的相关性

结果见表1。GNAI2蛋白与食管鳞癌分化程度、淋巴结转移情况、肿瘤侵袭深度、TNM分期以及5年生存情况具有明显的相关性(均P<0.05)，但是与患者的年龄和性别不具有相关性(均P>0.05)。

2.3 食管鳞癌患者预后与其临床病理特征之间的相关性

COX回归分析结果见表2，GNAI2表达情况及肿瘤分化程度是食管鳞癌患者的独立预后因素(表2，P<0.05)。

表2 食管鳞癌患者预后影响因素的Cox回归分析Table 2 Cox regression analysis of prognostic factors of patients with esophageal squamous cell carcinoma

2.4 GNAI2阳性组和阴性组与食管鳞癌5年生存预后相关性

结果见表3、图2、图3。50例食管鳞癌患者的术后5年总生存率为32.00%，中位生存时间为(33.00±3.03)月。其中GNAI2蛋白表达阳性组5年生存率为18.75%，中位生存时间为(31.00±2.12)月；GNAI2蛋白表达阴性组的5年生存率为55.56%；GNAI2蛋白表达阳性组明显低于GNAI2蛋白表达阴性组，差异具有统计学意义(图3，χ2=6.022，P=0.014)。

表3 GNAI2阳性组与阴性组食管鳞癌患者生存时间(月)的均数和中位数Table 3 Mean and median survival time(months) of patients with esophageal squamous cell carcinoma in the GNAI2 positive and negative groups

图2 食管鳞癌患者术后5年Kaplan-Meier生存曲线Fig.2 Kaplan-meier specific survival curve in patients with esophageal squamous cell carcinoma 5 years after operation

3 讨论

近年来食管鳞癌的发病率和死亡率不断呈上升趋势。目前虽然对于食管鳞癌有手术、化疗、放疗等治疗手段，但是患者预后仍较差。因此，为改善治疗效果，提高患者整体预后水平，寻找并研究影响食管鳞癌发生、发展的因素，预测肿瘤发展预后情况，找到新的分子靶点，在食管鳞癌治疗中具有重要临床意义。

图3 GNAI2阳性组与阴性组食管鳞癌患者术后5年Kaplan-Meier生存曲线Fig.3 Specific Kaplan-meier survival curves for patients with GNAI2 positive/negative esophageal squamous cell carcinoma 5 years after surgery

G蛋白，即鸟苷酸结合蛋白，由α、β、γ等3个亚单位组成异源三聚体，是细胞内一类重要的信号传导蛋白[14]。根据亚单位的不同，G蛋白有不同的分类，结构上的差别主要表现在α亚单位(Gα)，根据Gα的DNA序列同源性不同，Gα分为Gi、Gq、Gs、G12等4个家族。GNAI2属于Gi类的一个抑制型。Li等[13]采用组织学、免疫印迹、免疫组织化学和RNA测序分析等手段进行的研究表明，与正常组织相比，结直肠癌患者的结肠肿瘤组织中GNAI1和GNAI3水平降低，GNAI2水平升高，对人类结直肠肿瘤DNA微阵列公共数据库(GSE39582)的进一步分析表明，低GANI1和GNAI3 mRNA表达以及高GNAI2 mRNA表达与总生存时间的减少显著相关；Jiang等[8]研究发现GNAI2在舌鳞状细胞癌中异常高表达，并与舌鳞状细胞癌的病理因素相关，其表达水平与舌鳞状细胞癌患者生存呈负相关；陈宁等[10]对60例前列腺癌和前列腺增生组织中GNAI2蛋白表达量进行检测，癌组织中GNAI2表达高于前列腺增生组织，且临床分期越晚其表达量越高，提示GNAI2对前列腺癌的发生发展起促进作用；Fu等[15]检测了miR-222-3p在上皮卵巢癌患者、小鼠模型和细胞系中的表达，发现miR-222-3p的高表达与上皮卵巢癌患者的总体生存率相关，其表达水平与体内肿瘤生长呈负相关。此外，体外实验表明miR-222-3p抑制上皮卵巢癌细胞的增殖和迁移，并降低AKT的磷酸化。GNAI2为miR-222-3p的靶标，该研究还发现GNAI2促进上皮卵巢癌细胞增殖，是PI3K/AKT途径的激活剂，可作为上皮卵巢癌患者新的治疗靶点。

本研究显示，相对于癌旁组织而言，GNAI2蛋白在食管鳞癌组织中有较高的阳性表达率，我们猜想GNAI2蛋白表达的上调很有可能影响着食管鳞癌的发生、发展。低分化癌组织中GNAI2蛋白的阳性表达率高于高、中分化组织，表明GNAI2的表达水平可能与肿瘤进展程度有关。对于TNM分期，我们可以看到Ⅰ、Ⅱ期食管鳞癌患者相对于Ⅲ、Ⅳ期患者，GNAI2蛋白阳性表达率明显降低；在淋巴结转移情况中，有淋巴结转移的患者GNAI2的阳性表达率明显升高，表明在一定程度上患者病情越重，GNAI2表达水平越高。GNAI2为食管鳞癌患者预后的独立危险因素的结果提示我们GNAI2在食管鳞癌的治疗中可以作为预后判断的指标。并且，根据生存分析结果，GNAI2蛋白表达阳性组5年生存率明显低于阴性组，表明GNAI2蛋白的高表达可显著降低食管鳞癌患者的生存率，抑制GNAI2的表达可能是食管鳞癌靶向治疗的潜在分子靶点。

综上所述，GNAI2与食管鳞癌分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关，GNAI2可能促进了食管鳞癌的发生和发展过程，可以作为食管鳞癌早期诊断和预后评估的参考依据，同时，抑制GNAI2可能是食管鳞癌靶向治疗的潜在靶点之一。