孕激素对白假丝酵母菌刺激的小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎性体表达的影响*

许 莉， 陈 娜

武汉市第一医院皮肤科，武汉 430022

外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一种常见的阴道黏膜真菌感染性疾病，白假丝酵母菌是最常见的致病菌。VVC的主要症状为外阴瘙痒，阴道灼热感，部分患者阴道分泌物增多，呈白色凝乳或豆渣样，可通过性接触传染[1]。约75%育龄妇女在一生中至少感染一次VVC，其中约半数病例出现再次发作，5%病例最终发展为复发性VVC[1]。有研究发现孕妇阴道假丝酵母菌病发病率增高，而妊娠增加宿主对细菌、病毒、真菌的易感性可能与孕激素水平增高导致的免疫抑制效应有关[2]。但孕激素是通过何种途径下调机体的免疫应答，发挥免疫抑制作用，并最终导致假丝酵母菌感染的发生，至今仍未阐明。NLRP3炎性体是一类大分子蛋白质，它可激活半胱天冬酶-1(Caspase-1)，进而促进促炎细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-18剪切为成熟的IL-1β、IL-18并分泌，在天然免疫、获得性免疫反应中发挥重要作用[3]。IL-1β是一种具有多种免疫调节功能的炎性细胞因子，它可通过诱发炎性反应及机体的防御反应而参与抗白假丝酵母菌免疫反应[4]。IL-18又称IFN-γ诱导因子，主要由巨噬细胞产生，可诱导T细胞和NK细胞产生IFN-γ，在抗真菌感染中发挥重要作用[5]。Simitsopoulou等[6]发现白假丝酵母菌通过核因子(NF)-κB活化途径诱导人外周血单核细胞NLRP3表达的增加。此外，有研究显示孕激素可下调NF-κB的表达和活性[7]。我们猜测孕激素可能通过调节NF-κB活性，进而影响白假丝酵母菌刺激的巨噬细胞NLRP3表达及IL-1β、IL-18分泌。本研究观察孕激素对白假丝酵母菌刺激后小鼠腹腔巨噬细胞内NLRP3炎性体表达及炎性细胞因子IL-1β、IL-18分泌的影响，探讨孕激素在白假丝酵母菌感染中的免疫抑制机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

RPMI 1640培养液(Gibco)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，孕酮(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，逆转录试剂盒(TOYOBO)，SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa)，anti-NLRP3抗体(Abcam)，anti-NF-κB p65单抗(Santa)，anti-Caspase-1 p20单抗(Santa)，IL-1β ELISA试剂盒(Abcam)，IL-18 ELISA试剂盒(Abcam)。

1.2 菌株

所用白假丝酵母菌为澳大利亚悉尼Westmead医院感染性疾病和微生物研究中心提供的标准菌株ATCC10231。实验前1 d将白假丝酵母菌转种到新鲜的沙氏培养基上培养24 h后，取半环菌落于灭菌的PBS中，1500 r/min离心8 min，PBS洗涤2次，再用含小牛血清的RPMI 1640培养液将白假丝酵母菌调成106CFU/mL的悬液备用，锥虫蓝染色证实活细胞数>95%。

1.3 小鼠腹腔巨噬细胞体外培养及处理

雌性BALB/c小鼠(6～8周龄，体质量18～20 g)由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。常规提取小鼠腹腔巨噬细胞，按2×105/cm2接种于6孔板中，每孔加入2 mL含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃、5%CO2培养箱中培养。待巨噬细胞贴壁后，更换培养液，将细胞分为5个实验组。①空白对照组：用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养8 h；②白假丝酵母菌组：加入106CFU/mL白假丝酵母菌悬液作用巨噬细胞8 h；③白假丝酵母菌+1×10-9mol/L孕酮组：预先用1×10-9mol/L孕酮作用巨噬细胞2 h，再加入106CFU/mL白假丝酵母菌悬液作用巨噬细胞8 h；④白假丝酵母菌+1×10-8mol/L孕酮组：预先用1×10-8mol/L孕酮作用巨噬细胞2 h，再加入106CFU/mL白假丝酵母菌悬液作用巨噬细胞8 h；⑤白假丝酵母菌+1×10-7mol/L孕酮组：预先用1×10-7mol/L孕酮作用巨噬细胞2 h，再加入106CFU/mL白假丝酵母菌悬液作用巨噬细胞8 h。

1.4 实时荧光定量PCR检测细胞中NLRP3 mRNA表达

用Trizol试剂提取巨噬细胞总RNA，每组取1 μg总RNA逆转录成为cDNA。取1 μL cDNA产物进行PCR反应。RT-PCR所用引物序列如下，NLRP3上游：5′-AAGCAGCAGATGGAGACTGGAAA-3’，下游：5′-TGAACAGAGCCCTGGCAGGTAG-3′，扩增产物为149 bp；内参β-actin上游：5′-TTCCTTCTTGGGTATGGAAT-3′，下游：5′-GAGCAATGATCTTGATCTTC-3′，扩增产物为203 bp。

1.5 Western blot检测NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表达

分别提取培养的巨噬细胞的胞核蛋白和胞质蛋白。提取的胞核蛋白用作NF-κB p65蛋白Western blot分析，胞质蛋白用作NLRP3和Caspase-1 p20蛋白Western blot分析。取各组不同组分蛋白样品经10% SDS-PAGE电泳分离，然后将目的蛋白转至PVDF膜上。加入稀释后的一抗4℃孵育过夜，洗膜3次后加入稀释的HRP标记的二抗37℃孵育2 h，洗膜3次后用DAB缓冲液避光显色。

1.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中IL-1β、IL-18含量

严格按照试剂盒说明书进行操作，实验完成后使用酶标仪在450 nm处读取样本的吸光度值(A450nm)，依据制作的标准曲线，间接法计算各组样本的IL-1β、IL-18含量。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 巨噬细胞内NLRP3 mRNA表达的变化

加入白假丝酵母菌刺激小鼠腹腔巨噬细胞8 h，细胞内NLRP3 mRNA的表达水平较空白对照组升高(P<0.01)。加入孕酮预处理2 h后，细胞内NLRP3 mRNA的表达水平随着孕酮作用浓度的升高而逐渐降低。1×10-7mol/L及1×10-8mol/L孕酮可以明显降低白假丝酵母菌引起的巨噬细胞内NLRP3 mRNA表达增加，与白假丝酵母菌组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)，见图1。

1：空白对照组；2：白假丝酵母菌组；3：白假丝酵母菌+1×10-9mol/L孕酮组；4：白假丝酵母菌+1×10-8mol/L孕酮组；5：白假丝酵母菌+1×10-7mol/L孕酮组；与空白对照组比较，*P<0.01；与白假丝酵母菌组比较，#P<0.01图1 荧光定量PCR检测小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3 mRNA表达Fig.1 Detection of NLRP3 in murine peritoneal macrophages by real-time PCR

2.2 巨噬细胞内NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表达的变化

不同组别小鼠腹腔巨噬细胞Western blot结果显示，白假丝酵母菌组细胞内NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表达水平较空白对照组均明显增加，分别为其6.21倍、5.50倍和4.86倍。加入孕酮预处理2 h后，细胞内NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表达水平随着孕酮作用浓度的升高而逐渐降低。加入1×10-7mol/L或1×10-8mol/L孕酮可以明显降低白假丝酵母菌刺激引起的巨噬细胞内NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表达水平升高，与白假丝酵母菌组比较，差异有统计学意义(均P<0.01)(图2、3)。

2.3 培养上清中细胞因子IL-1β、IL-18含量的变化

加入白假丝酵母菌刺激小鼠腹腔巨噬细胞8 h，细胞培养上清中IL-1β、IL-18含量均较空白对照组升高，差异有统计学意义(均P<0.01)。加入孕酮预处理2 h后，细胞培养上清中IL-1β、IL-18水平随着孕酮作用浓度的升高而逐渐降低。加入1×10-7mol/L或1×10-8mol/L孕酮可以明显降低白假丝酵母菌刺激引起的巨噬细胞IL-1β、IL-18分泌，与白假丝酵母菌组比较，差异有统计学意义(均P<0.01)(表1)。

1：空白对照组；2：白假丝酵母菌组；3：白假丝酵母菌+1×10-9mol/L孕酮组；4：白假丝酵母菌+1×10-8mol/L孕酮组；5：白假丝酵母菌+1×10-7mol/L孕酮组图2 免疫印迹法检测巨噬细胞内NLRP3、Caspase-1 p20、NF-κB p65蛋白表达Fig.2 Detection of NLRP3，Caspase-1 p20 and NF-κB p65 in murine peritoneal macrophages by Western blotting

1：空白对照组；2：白假丝酵母菌组；3：白假丝酵母菌+1×10-9mol/L孕酮组；4：白假丝酵母菌+1×10-8mol/L孕酮组；5：白假丝酵母菌+1×10-7mol/L孕酮组；与空白对照组比较，*P<0.01；与白假丝酵母菌组比较，#P<0.01图3 NLRP3、Caspase-1 p20、NF-κB p65蛋白表达统计结果Fig.3 Comparison of NLRP3，Caspase-1 p20 and NF-κB p65 protein expression levels among different groups

表1 培养上清中细胞因子IL-1β、IL-18含量的变化Table 1 The levels of IL-1β and IL-18 in the

3 讨论

NLRP3炎性体是由核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族成员NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白Caspase-1组成的一种分子量约为700 kD的大分子多蛋白复合体，在细胞质内发挥外源性微生物或内源性危险信号感受器的作用，是Caspase-1活化所必需的反应平台[3]。NLRP3炎性体组装并激活，将无活性的Caspase-1前体转化为活性Caspase-1，活化的Caspase-1可将不活跃的IL-1β、IL-18前体加工成成熟的促炎细胞因子并分泌，引起炎症反应[3]。本实验中，我们发现，给予白假丝酵母菌刺激后小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3 mRNA表达显著增加，胞质内NLRP3蛋白表达及活化形式的Caspase-1 p20蛋白表达也显著增加，细胞上清中IL-1β、IL-18的分泌亦相应地显著增加。实验结果表明，在白假丝酵母菌感染小鼠腹腔巨噬细胞的体外模型中，NLRP3炎性体参与了Caspase-1的活化及炎性细胞因子IL-1β、IL-18的分泌。在白假丝酵母菌感染中，IL-1β作为一种重要的促炎反应介质，可以活化T细胞并间接活化B细胞、提高粘附分子表达、诱导一系列其它促炎性细胞因子以及炎性相关蛋白表达，形成炎性反应的放大级联反应，增强机体的抗真菌免疫反应及组织损伤过程[4]。Borghi等[5]发现复发性VVC患者阴道分泌物中IL-18水平低于健康对照者，IL-18缺乏可导致VVC易感性增加和Th17/Treg失衡，提示IL-18可能在宿主防御假丝酵母菌感染中发挥了重要作用。

孕激素与VVC关系非常密切，在黄体期的女性及孕妇容易感染假丝酵母菌性阴道炎[8]。妊娠期间孕妇体内高性激素水平导致阴道组织内糖原增多，为假丝酵母菌的生长和繁殖提供了良好的碳源，可导致VVC反复发作且症状严重[8]。已有研究发现假丝酵母菌存在类固醇结合蛋白，孕激素可促进假丝酵母菌形成假菌丝，耐药基因活化可使其毒力增强[9]。这些都说明孕激素对机体具有免疫调节功能，能影响宿主对假丝酵母菌的易感性及炎症反应。

NF-κB是一种重要的多功能核转录因子，最常见的活化形式是NF-κB p65，它激活后参与众多基因的转录调控，可诱导多种细胞因子、粘附分子、趋化因子等的表达[10]。孕激素主要是通过孕激素作用元件与NF-κB的相互作用引起免疫抑制效应，孕激素预处理能有效地抑制NF-κB p65亚基的核转位，且NF-κB p65亚基核转位的抑制反映了NF-κB活性的下降[11]。本实验中，加入不同浓度的孕酮预处理后，随着孕酮浓度的增加，白假丝酵母菌刺激小鼠腹腔巨噬细胞的NLRP3 mRNA表达水平，胞质内NLRP3蛋白和活化形式的Caspase-1 p20蛋白表达以及细胞上清中IL-1β、IL-18的分泌均逐渐降低，且这种逐渐降低的趋势与胞核内NF-κB p65蛋白的逐渐减少趋势一致。这表明孕酮可抑制白假丝酵母菌刺激引起的巨噬细胞NLRP3表达及IL-1β、IL-18分泌，且这种抑制作用可能是通过抑制NF-κB活性实现的。

在本研究中我们发现，在白假丝酵母菌感染时NLRP3炎性体的活化参与了炎性细胞因子IL-1β、IL-18的分泌，孕激素可以抑制NLRP3表达水平及炎性细胞因子IL-1β、IL-18分泌，且孕激素对NLRP3的抑制作用可能与其抑制NF-κB活性有关。这为解释孕激素在VVC妇女发病中的免疫调节机制提供了一定的科学依据。