复方甘桑洗液抗菌及止痒作用研究

侯小涛，李 聪，郝二伟，杜正彩，许翠霞，邓家刚

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中药药效研究重点实验室，广西 南宁 530200；3.广西农作物废弃物功能成分研究协同创新中心，广西 南宁 530200）

甘蔗叶是禾本科植物甘蔗SaccharumOfficinarum的干燥叶，八角茴香叶为木兰科植物八角Illicium verumHook.f.的新鲜叶子，柚叶为芸香科植物柚Citrus grandis（L.）Osbeck 的新鲜叶子，三种均为农业生产中的农作物废弃物。目前，国内外对甘蔗叶、柚叶、八角茴香叶等农作物废弃物的处理方法多为焚烧和丢弃，造成严重的资源浪费和环境污染。前期研究显示，此3 种农作物废弃物均具有一定的药用价值。中药洗液是常见的外用制剂，临床中常用于妇科炎症［1-2］、皮炎［3］、湿疹［4］、痔疮术后［5］等，具有起效快、安全、制备工艺简单等特点。为充分利用农作物废弃物，变废为宝，提高甘蔗、柚、八角茴香3 种农作物的经济价值，广西农作物废弃物功能成分协同创新中心主任邓家刚教授结合临床用药经验，以甘蔗叶、桑白皮、柚叶、八角茴香叶、两面针、救必应、薄荷油组成复方甘桑洗液，临床用于妇科炎症具有较好疗效。本研究探讨复方甘桑洗液的抗菌、止痒作用，为开发新制剂及其临床应用提供科学依据。

1 实验材料

1.1菌种 大肠埃希菌（ATCC29522）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、白色念珠菌（ATCC10231）等3 株菌种购自广东省微生物菌种保藏中心；铜绿假单胞菌（ATCC27853）由广西中医药大学微生物与免疫教研室保藏中心提供。

1.2动物 SPF级ICR种小鼠60只，雌性，体质量20±2 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-002。小鼠自由摄食和饮水，温度20～25 ℃，相对湿度55%～70%，自然光照，实验前适应性喂养7 d。

1.3主要药物与试剂 复方甘桑洗液（广西大海阳光药业有限公司，批号：S161201）；洁尔阴洗液（四川恩威制药有限公司，批号：170417）；营养琼脂（批号：1064851）、马铃薯葡萄糖琼脂（批号：3105780）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：3106001）、麦氏比浊管（批号：5105248）均由广东环凯微生物科技有限公司生产；4-氨基吡啶（上海麦克林生化科技公司，纯度98%，批号：C10096638）；硫化钠（分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号：20170327）。

1.4仪器 牛津杯（规格：7.8 mm×6.0 mm×10.0 mm）；超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-2FD）；生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：LRH-150F）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号：YXQ-LS-50S11）；电子数显游标卡尺（日本Mitutoyo公司，型号：500-196）。

2 方法与结果

2.1复方甘桑洗液的制备 将甘蔗叶750 g、桑白皮300 g、救必应450 g、毛两面针750 g 等4 味药除去杂质，用纯净水冲冼干净，稍润，切段，收集在托盘中，置烘房内于60 ℃下干燥至含水量为8%～12%。取出，装入洁净的容器中备用。新鲜柚叶及八角茴香叶除去杂质后用纯净水冲冼干净，稍润，取出，装入洁净的容器中备用。按多功能提取罐操作规程进行操作，将净制后的八角茴香叶450 g、柚叶450 g置提取罐内，加入6倍药材量的水，提取挥发油，另存；药渣加入甘蔗叶、桑白皮、救必应、毛两面针中，每次加入8 倍药材量的水，回流提取2次，每次1 h（煮沸开始计时），合并提取液，过滤，浓缩成稠膏状（相对密度不低于1.10），取出置干燥洁净的容器内备用。将浓缩后的稠膏置离心机中离心，除去不溶性及其他大分子的杂质，取出置洁净容器内备用。将离心后的稠膏加入配制罐中，加入挥发油，再加入纯化水至5 L，过滤，加薄荷油10 g搅拌混合均匀，灌装，辐射灭菌，制成含生药量为0.62 g/ml 洗液。此制备过程由广西大海阳光药业有限公司制剂车间完成。

2.2体外抑菌实验

2.2.1菌种复苏及传代 按说明书分别配制营养琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基，热溶解后倒入90 mm 玻璃平板，铺板厚度为4～5 mm，放凉凝固后备用。取出菌种后将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等3种细菌划线接种于营养琼脂培养基平板上，白色念珠菌则接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，之后将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌各含细菌平板置于37 ℃生化培养箱中培养24 h，白色念珠菌置于25 ℃生化培养箱中培养72 h。菌种复苏后传代2次以上备用。

2.2.2牛津杯法体外抑菌实验［6-7］取活化后的菌种，用接种环挑取少量菌落，放置装有适量无菌生理盐水中，充分震摇后用0.5 麦氏比浊管进行比浊，再将菌悬液浓度调整至1×106～6×106CFU/ml，用无菌一次性拭子蘸取菌悬液均匀涂抹于营养琼脂平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，将3 个牛津杯等距离放置于含菌平板上，按每个0.2 ml的量依次加入复方甘桑洗液、无菌生理盐水、洁尔阴洗液，设3个平行实验。将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌含细菌平板置于37 ℃生化培养箱中培养24 h，白色念珠菌含细菌平板置于25 ℃生化培养箱中培养72 h。用游标卡尺测量抑菌圈直径，试验重复3次，结果以均数±标准差（±s）表示。抑菌圈直径＜6 mm 为耐药；抑菌圈直径6～9 mm为轻度敏感；抑菌圈直径10～14 mm 为中度敏感；抑菌圈直径15～20 mm 为高度敏感；抑菌圈直径＞20 mm 为极度敏感。结果见表1。结果显示，复方甘桑洗液对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌均为轻度敏感，对金黄色葡萄球菌为极度敏感，其抑制效果略优于阳性药洁尔阴洗液。

表1 牛津杯法测定药物抑菌圈直径的结果 （mm，±s）

表1 牛津杯法测定药物抑菌圈直径的结果 （mm，±s）

药物复方甘桑洗液洁尔阴洗液生理盐水大肠埃希菌6.59±0.42 22.35±0.49 0金黄色葡萄菌23.05±1.47 21.04±0.51 0铜绿假单胞菌6.89±0.36 32.84±0.87 0白色念珠菌6.47±0.69 17.45±1.35 0

2.2.3最小抑菌浓度测定（minimal inhibitory concentration，MIC）［8］取灭菌后营养琼脂及沙氏葡萄糖琼脂，趁热按二倍稀释法［9］配制成复方甘桑洗液药物浓度为620 mg/ml、310 mg/ml、155 mg/ml、77.5 mg/ml、38.75 mg/ml、19.38 mg/ml、9.69 mg/ml、4.84 mg/ml、2.42 mg/ml、1.21 mg/ml 共10 个梯度的含药培养基，每梯度分3 份并按梯度顺序标记1～10 后倾入培养皿中冷却凝固后备用。另取1∶1配制的含洁尔阴洗液药液琼脂平板3 个作阳性对照组，无药物琼脂培养基3 个作阴性对照组。同样制备方法制备2 份，分别用于检测药物对细菌及白色念珠菌的MIC。取活化后的菌种，配制浓度为1.0×108CFU/ ml 菌悬液。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌3 种细菌等距离“之”字划线接种于含药营养琼脂平板中，白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂平板中，将接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌菌种后的平板置于37 ℃生化培养箱中培养24 h，接种白色念珠菌菌种后的平板置于25 ℃生化培养箱中培养72 h。培养结束后取出，2名研究者同时在光线充足的地方观察，以完全无菌落生长的平板为复方甘桑洗液对该菌的最小抑制浓度（MIC），实验重复3 次。结果显示，复方甘桑洗液对白色念珠菌和大肠埃希菌的MIC为620 mg/ml，对铜绿假单胞菌的MIC值为155 mg/ml，对金黄色葡萄球菌MIC值为38.75 mg/ml。结果见表2。

表2 琼脂稀释法体外抑菌实验结果

2.3对4-氨基吡啶（4-Aminopyridine，4-AP）致痒小鼠的影响［10-11］取ICR 雌性小鼠50 只，适应性喂养后，用10%硫化钠（新鲜制备的纯水配制）对每只小鼠颈背部脱毛，脱毛区域面积约为2 cm×2 cm。24 h 后选取脱毛区域无创口的小鼠40 只，随机分为4 组：复方甘桑洗液高剂量组、复方甘桑洗液低剂量组、洁尔阴对照组及模型组。将小鼠称重后，按照小鼠面积0.2 ml/cm2剂量用棉签涂抹给药，复方甘桑洗液高剂量组予100%浓度的复方甘桑洗剂，复方甘桑洗液低剂量组予50%浓度的复方甘桑洗液，洁尔阴对照组予100%浓度的洁尔阴洗液，模型组予纯水，每间隔2 h给药1次，每天5次，给药2 d，末次药后1 h按10 mg/kg（用生理盐水配制成0.1 mg/ml）剂量给每只小鼠背部给药区域中心皮下注射4-AP，注射后观察10 min 内小鼠舔背部的次数，以连续舔体后出现短暂的间隔为1 次，各组舔体次数以均值±标准差（±s）表示。结果见表3。结果显示，背部涂抹复方甘桑洗液药液后的小鼠舔体次数显著减少，给药浓度对小鼠舔体次数影响较小，高剂量组小鼠舔体次数略低于低剂量组，复方甘桑洗液高、低剂量组的止痒作用均显著优于洁尔阴对照组（P＜0.01）。

表3 各组10 min内小鼠舔体次数比较 （±s）

表3 各组10 min内小鼠舔体次数比较 （±s）

注：与模型组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与洁尔阴对照组比较，③P＜0.01

组 别模型组复方甘桑洗液高剂量组复方甘桑洗液低剂量组洁尔阴对照组n 10 10 10 10浓度（%）—100 50 100舔体次数（次）22.60±6.48 6.30±2.94②③8.00±3.20②③15.50±5.28①

3 讨 论

复方甘桑洗液由甘蔗叶、桑白皮、柚叶、八角茴香叶、两面针、救必应、薄荷油组成，其中甘蔗叶具有抗菌［12］、抗炎［13］、降血糖［14］、肝损伤保护［15］等作用，桑白皮具有抗炎镇痛、降血糖、抗病毒等作用［16］，在方中与甘蔗叶共为君药，提升甘蔗叶的抗炎效果。救必应为冬青科植物铁冬青的树皮，具有抗菌、抗炎、镇痛等作用［17］；两面针为芸香科植物两面针的根和叶，具有抗菌、抗炎等作用［18］；两味中药均具有抗多种细菌及白色念珠菌的作用，在方中为臣药。八角茴香叶具有挥发油成分，其水提物具有一定的抗菌作用［19-20］；柚叶中的柚皮苷具有较好的抑制多种细菌生长的作用［21-23］，广西壮族民间常用于妇女产后康复；此两味药物具有一定的抗菌作用，且其挥发油气味芳香，与薄荷油共同起佐助作用，提升抑菌抗炎能力；并通过促进透皮吸收，使洗液具有较好的抑菌止痒能力。

阴道炎是常见的妇科疾病之一，其病因主要由于多种细菌（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等）、白色念珠菌及滴虫等病原体在阴道中过度增殖，使阴道内环境失衡而引起炎症，往往会伴随着外阴瘙痒。西医多用抗生素抑制病原体的增殖，中医多采用内服外治辨证治疗［24-25］。目前，测定药物对细菌的敏感性多采用抑菌圈法，其中包含了牛津杯法、K-B 法、打孔法，牛津杯法因其获得的抑菌圈质量高，重复性好及方法规范等优点而优于K-B 法及打孔法［26］。测定药物对菌种的MIC 时多采用琼脂稀释法、肉汤稀释法、微量稀释法3种，而复方甘桑洗液为棕褐色液体，使用琼脂稀释法可排除干扰，获得比较准确的实验结果，故而本研究使用牛津杯法检测复方甘桑洗液对4 株标准菌株的药物敏感性，以及使用琼脂稀释法测定MIC。结果显示，复方甘桑洗液对4 种标准菌株均有一定的抑制作用，对大肠埃希菌及白色念珠菌效果较差，对金黄色葡萄球菌效果最好，与市售阳性药（洁尔阴洗液）比较具有一定的优势。

瘙痒是一种能引起抓挠冲动的主观感觉，是神经反射导致的结果，由多种因素（蚊虫叮咬、炎症刺激等）导致。4-AP 是一种具有促进肥大细胞释放瘙痒介质组胺的化合物，被广泛应用于建立瘙痒动物模型中［27］。本研究采用皮下注射4-AP 于小鼠颈后部的方法建立瘙痒模型，给药后通过观察各组小鼠舔体次数测定复方甘桑洗液的止痒作用，结果显示复方甘桑洗液具有显著的止痒作用，且效果优于市售阳性药。

综上，本研究充分利用了农作物废弃物的药用功能，以传统抗菌中药组方，起到了显著的抗菌、止痒的作用，为将农作物废弃物开发成药用产品并应用于临床提供了科学依据，能为促进农业经济的发展提供支持。