Maspin 在胶质瘤中表达沉默的表观遗传学机制探讨

刘泓渊 成刚 李宗平( 通讯作者)

( 绵阳市中心医院神经外科 四川 绵阳 621000）

胶质瘤是最常见的中枢性肿瘤[1]。尽管经过积极的治疗，胶质瘤患者的预后仍较差。胶质瘤的预后与肿瘤分期、遗传和表观遗传学分子特征等生物学和临床特征相关。DNA 甲基化作为表观遗传学的一部分，被认为是人类肿瘤常见的分子学改变，通常发生在CpG 位点。在正常组织中，大量基因的CpG 位点未发生甲基化，但是在肿瘤中发生甲基化，如乳腺癌，卵巢癌，结肠癌、前列腺癌和胶质瘤。CpG 序列富集的DNA片段叫CpG 岛。CpG 岛甲基化与抑癌基因转录沉默密切相关。

乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂（maspin）在乳腺、前列腺、口腔等组织中表达，在上述癌组织中表达下调。Maspin 在正常脑组织及胶质瘤中的表达水平罕见报道。有研究表明在众多肿瘤中maspin 受表观遗传学调控，主要涉及到CpG 岛甲基化。生物信息学分析表明maspin 具有6 个CpG 岛，其中1 个位于启动子区，而maspin 在胶质瘤中表达沉默。本文旨在探索maspin 基因在胶质瘤中表达沉默与表观遗传学的关系。

1.资料和方法

1.1 主要材料

人前列腺癌细胞株PC3( 阳性对照)、胶质瘤细细胞株U343 来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-A z a-DC)来源于Sigma 公司，10% 胎牛血清为Hyclone 公司产品，RNA 提取试剂购自Invitrogen 公司，逆转录试剂盒和DNA 提取试剂盒为Fermentas 公司产品，甲基化试剂盒购自Zymo Research 产品。Maspin 引物由Invitrogen 设计、合成。MethPrimer 设计甲基化引物和非甲基化引物，primer6.0 设计内参GAPDH 基因引物。

1.2 细胞培养

细胞培养于含有10%胎牛血清及100U/m L 浓度的双抗的完全培养液。细胞置于37℃、5%CO2，相对湿度为90%的培养箱中。细胞贴壁生长，用胰酶消化传代。

1.3 RT-PCR 测定maspin 基因转录

提取PC3、U343 的R N A 并逆转录，PCR 扩增。Maspin基因引物序列为，上游5’-ctcgcttgcctgttcctt-3’，下游：5’-cgtagagccgcttgattagt-3’；GAPDH 为内参照，上游：5’-aatgggcagccgttaggaaa-3’，下游：5’-gcccaatacgaccaaatcagag -3’。PCR 扩增条件：94℃ 5min；94 ℃ 30s、52 ℃ 30s、72 ℃ 30s，33 循 环；72 ℃ 7min。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用Quantity One 对产物条带进行分析。

1.4 5-Aza-DC 处理

将胶质瘤细胞消化计数，以1×105个细胞/m L 的密度培养24h，分别加入终浓度为0μ M( 对照) 和12μ M 5-Aza-dC 培养96h,按照1.3 中方法提取RNA，检测maspin转录水平。

1.5 甲基化特异性PCR（MSP）检测maspin 基因启动子甲基化

MethPrimer 设计甲基化引物maspin（Mmaspin）及非甲基化maspin(Umaspin)。DNA 试剂盒提取PC3 及U343 DNA，使用甲基化试剂盒对二者DNA 进行修饰。采用Mmaspin 和Umaspin 引物检测maspin 基因的DNA 甲基化情况。Mmaspin引物序列序列，上游：5’-ttttatcgaatattttatttttcgg-3’，下游：5’-gataactcacctaaacaacaccg-3’；Umaspin 引物序列，上游：5’-ttttattgaatattttattttttgg-3’；下游：5’-caataactcacctaaacaacaccac-3’。扩增条件：94℃ 5min；94℃30s、56℃ 30s、72℃ 30s，40 个循环；72℃ min。琼脂糖凝胶电泳后使用Quantity One 对产物条带进行分析。

1.6 亚硫酸氢盐测序法(BSP)对启动子区域甲基化CpG位点进行检测

MethPrimer 软件设计BSP 引 物， 上 游：5-ga gaaatttgtagtgttattattattatat-3’， 下 游：5’-ataactcacctaaacaacacc-3’。使用甲基化试剂盒对P C3、U343 的DNA 进行甲基化修饰并扩增。扩增条件：94℃预变性5min；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s，40个循环；72℃ 7min。B S P 产物进行测序后使用FinchTV version1.4.0 和Sequence Scanner v1.0 分析。

1.7 统计学方法

数据采用SPSS19.0 统计学软件分析处理，计数资料采用率（%）表示，行χ2检验，计量资料用均数±标准差（±s）表示，行t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 PC3、U343 中maspin 基因的转录水平

运用RT-PCR 检测PC3、U343 细胞中maspin 转录情况。结果表明，在PC3 中maspin 基因转录表达，在U343 细胞中被表达沉默，见图1。

图1 A、B 为 RT-PCR 检测PC3、U343 细胞中 maspin 转录水平。*P ＜0.01。

2.2 5-Aza-DC 影响U343 细胞maspin 表达

使用0µM（对照），12µM5-Aza-dC 处理U343 细胞后，使用 RT-PCR 探查maspin 转录水平。结果显示，经过12µM 5-Aza-dC处理后maspin 在U343 细胞中恢复转录，见图2A。处理组和未处理组比较，差异有统计学意义（P ＜0.01），见图2B。结果显示maspin 在U343 细胞中的表达抑制可能与表观遗传学中的DNA 甲基化相关。

图2 A：5-Aza-DC 处理前后，运用RT-PCR 检测 maspin 基因表达水平变化。B：经5-Aza-DC 干预或未干预后细胞中 maspin 相对含量灰度值变化（-：未干预，+：干预）。*P ＜0.01。

2.3 Maspin 基因启动子甲基化分析

MSP 结果显示表明，maspin 基因启动子在PC3 细胞（对照组）中处于非甲基化状态，而在U343 细胞中处于甲基化状态，见图3。

图3 亚硫酸盐修饰PC3 及U343 细胞DNA 后，使用MSP 检测maspin 启动子在各组细胞中的甲基化状态。U：非甲基化扩增，M：甲基化扩增。

2.4 Maspin 基因启动子区域CpG 位点甲基化分析

BSP 测序结果显示在U343 细胞中预期的甲基化位点中胞嘧啶未发生转变发生了甲基化。而在PC3 细胞中预期的位点中胞嘧啶发生转变未发生甲基化，见图4。

图4 各组细胞DNA 经亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶C 转化为尿嘧啶U，而甲基化则不变仍为C。PC3 中C 均转化为T，而U343 中C 均未转化为T。

3.讨论

Maspin 是1994 通过消减杂交法和差异显示分析技术从乳腺上皮细胞中分离的候选抑制基因，编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。Maspin 基因在包括乳腺、前列腺等众多组织中表达，然而在上述肿瘤中表达下降。而maspin 在胶质瘤中表达情况少有报道。通过RT-PCR 检测分析发现U343 细胞中不表达maspin 基因。Maspin 具有调节细胞浸润、降低细胞运动能力、抑制肿瘤血管的生成等抑癌基因特性。因而研究maspin 在胶质瘤中沉默机制具有重要的意义。

DNA 甲基化作为表观遗传学的重要修饰方式，启动子区域DNA 异常甲基化是基因表达沉默常见的机制[2]。异常的DNA 甲基化通常CpG 区，富集CpG 序列DNA 片段叫CpG 岛。5-Aza-DC 通过抑制DNA 甲基转移酶使DNA 去甲基化使基因恢复转录从而发挥正常功能[3-4]。据报道，胶质瘤的发生与甲基化导致抑癌基因失活相关，如EMP3 基因。通过5-Aza-DC 干预U343 细胞后maspin 基因重新转录表达表明，其表达沉默与DNA 甲基化有紧密的联系。通过生物信息学分析发现maspin 基因启动子区存在CpG 岛，更加证实了两者的相关性。

MSP 是检测DNA 甲基化的有效方法[5]。亚硫酸盐处理胶质瘤的DNA 后，未甲基化的胞嘧啶C 转化为尿嘧啶U，而甲基化的胞嘧啶C 不变。MSP 结果反映在U343 细胞中maspin 基因启动子区域处于甲基化状态。使用亚硫酸氢盐测序法进一步探索其甲基化CpG 位点。测序发现maspin 启动子区域的预期甲基化CpG 位点均发生了甲基化。

上述研究表明，maspin 在胶质瘤中的表达沉默与其启动子CpG 岛甲基化有关，DNA 甲基化抑制剂5-Aza-DC 可诱导maspin基因在U343 细胞中恢复表达。