一种迎春花叶枯病新病原菌的分离与鉴定

孟祥佳 龙欣钰 曹帅 刘艳华 Rudoviko Galieya Medison 孙正祥

摘 要：迎春花（Jasminum nudiflorum Lindl.）是一种既有观赏价值又有药用价值的植物。2021年6月，湖北省荆州市发现了一种可以使迎春花叶片枯萎的真菌病害，其发病癥状与已报道的迎春花病害不完全相同。为分离鉴定该病原菌并为该病害的后续研究和防治提供理论依据，本文采用组织分离和单孢分离法从病叶的病健交界处获得分离物;采用菌丝和孢子悬浮液2种方法接种迎春花进行致病性测定;通过观察致病菌的形态特征和分析其rDNA-ITS和nLSU基因序列相结合的方法确定其分类地位。结果表明，从病组织中共分离获得5株不同的真菌，接种试验发现仅有菌株YC1-1可以使迎春花发病，接种症状与自然发病的症状相同，并能从发病部位再次分离到原接种的菌物。经形态学及分子生物学鉴定，引起迎春花叶枯病的病原菌为Phlebiopsis crassa。这是世界上首次报道Phlebiopsis crassa引起迎春花叶枯病。

关键词：迎春花;叶枯病;病原菌;鉴定;Phlebiopsis crassa

中图分类号：S476                                 文献标志码：A

Isolation and Identification of a New Pathogen Causing Leaf Blight on Jasminum nudiflorum Lindl

MENG Xiangjia，LONG Xinyu，CAO Shuai，LIU Yanhua，

Rudoviko Galieya Medison，SUN Zhengxiang*

（ College of Agriculture， Yangtze University / Forewarning and Management of

Agricultural and Forestry Pests， Hubei Engineering Technology Center， Jingzhou，

Hubei 434025， China）

Abstract：Winter jasmine is a plant with both ornamental and medicinal value. In June 2021， a fungal disease that caused leaves wilt on winter jasmine was found in Jingzhou city， Hubei province， which symptom is not exactly the same as that has been reported. The study aims to isolate and identify the pathogen and provide theoretical basis for the follow-up research and prevention of the disease. The pathogenic fungi were obtained by tissue isolation and single spore isolation from the junction of diseased leaves. The pathogenicity was determined by inoculating the host plant with mycelium and spore suspension. The taxonomic status of pathogen was determined by observing their morphological characteristics and analyzing their rDNA-ITS and nLSU gene sequences. The results showed that a total of 5 different fungi were isolated from the diseased tissues. The pathogenic test showed that only one strain YC1-1 could cause jasmine leaf wilt， and the symptoms were the same as those of field， and the original inoculated fungi could be re-isolated. Morphological and molecular characteristics showed the pathogen causing jasmine leaf blight was Phlebiopsis crassa. This is the first report of winter jasmine leaf blight caused by Phlebiopsis crassa in the world.

Key words： Jasminum nudiflorum; leaf blight; pathogen; identification; Phlebiopsis crassa

迎春花（Jasminum nudiflorum Lindl.） 属于木犀科素馨属落叶灌木，也被称为金腰带、黄素馨，原产于我国甘肃、陕西、四川、云南西北部以及西藏东南部[1]。迎春花因为较易成活、生长较快、耐旱能力较强以及观赏性较高等特点，通常作为景观植物种植在全国乃至世界各地[2]。除此之外，迎春花具有清热解毒的功效，有重大的药用价值[3，4]。2021年6月在湖北省荆州市荆州区长江大学西校区（N 30° 21′，E 112° 8′）进行植物病害调查时发现迎春花出现枝叶枯萎症状，发病率约40 %，严重影响了迎春花的观赏价值与药用价值，并且其发病症状与已报道的迎春花病害不完全相同。因此，分离和鉴定迎春花叶枯病的病原菌，可为该病害的后续研究和防治提供理论依据。目前，国内外对迎春花的研究主要在生理、栽培和提取物方面，如刘芳等[5]试管培养技术使迎春花生根率达到85 %;陈意兰等[6]研究了不同程度干旱胁迫对迎春花叶片丙二醛（MDA） 含量和3种抗氧化酶活性的影响;Gu等[7]对迎春花提取物和热解产物进行鉴定发现多种化合物被广泛应用于医疗、能源和食品工业。目前关于迎春花病害方面的报道相对较少，本研究发现的迎春花叶枯病症状与已报道的迎春花病害不完全相同，推测为一种新病害，分离和鉴定其病原具有重要的研究价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料：感病枝条及健康枝条于2021年6月采自于湖北省荆州市长江大学西校区。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextrose agar，PDA）培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、蒸馏水1 L。

1.2 病原菌的分离

2021年6月，从湖北省荆州市荆州区长江大学西校区采集迎春花的发病枝条，在病健交界处切取组织块（2 mm × 2 mm），各组织块依次用70 %乙醇和2.5 %次氯酸钠表面消毒2 min，之后用无菌水冲洗4次[8]。将消毒后的组织块转移至含有链霉素（50 mg/L）的PDA平板上，置于26℃培养箱中待分离物长出后采用单孢分离法纯化培养[9]。将获得的纯培养物保存于PDA 斜面（4 ℃）及15 %甘油中（-80℃），备用。

1.3 致病性测定

根据柯赫氏法则对供试菌株进行致病性测定。选取健康且长势一致的迎春花枝条进行水培生长[10]，用无菌昆虫针对待接种枝叶处进行刺伤处理。本研究分别采用菌丝块接种法和孢子液接种法分别进行致病性检测。

1.3.1 菌丝块致病性测定

待测真菌纯化培养5 d后，用直径为5 mm打孔器在平板边缘打取菌饼并使有菌丝面接触伤口，并用聚乙烯袋包裹保湿24 h。以接种无菌的PDA菌饼为对照，每个处理3次重复。放置于温室（28 ℃，光照培养16 h，黑暗培养8 h）中培养[11-12]。接种后，逐日观察发病情况，待发病后，从发病组织上分离病原菌，观察是否与接种病原菌的性状一致。

1.3.2 孢子液致病性测定

待测真菌纯化培养5 d后，用无菌水洗脱分生孢子，过滤后离心，再用灭菌水将滤液配制成孢子悬浮液（107 个/mL）。用无菌脱脂棉蘸取配制好的孢子悬浮液放置于伤口处，以蘸有无菌水的脱脂棉作对照[13]。培养条件及后续工作与1.3.1相同。

在初步确定病原菌后，为保证致病性实验准确性，在原始发病地点选择健康迎春花枝条进行室外孢子液致病性实验，实验方法与上述相同。

1.4 病原菌形态学鉴定

菌落形态：供试菌株在PDA培养基上培养2～3 d后用直径5 mm的无菌打孔器打取菌落边缘的菌丝块，转接于新的PDA培养基（90 mm培养皿）中央，置于25 ℃恒温黑暗培养箱中培养，每天观察菌落形态，并测量菌落直径。

孢子形态：挑取少量待试菌株菌丝转接于PDA培养基上，将无菌盖玻片斜插入PDA培养基中距菌饼15 mm处，置于25 ℃恒温条件下，每天8 h光照的培养箱中培养，待菌丝完全覆盖盖玻片后，通过显微镜观察并记录其分生孢子产孢方式、形态、颜色及大小，初步确定病原菌的分类学地位。

1.5 病原菌分子鉴定

采用CTAB法提取病原真菌的DNA，分别用引物ITS1/ITS4[14]、LROR/LR7[15]进行PCR扩增（引物均有华大基因有限公司提供）。PCR 反应体系总体积：2×SuperStar PCR Mix 12.5 μL，正、反向引物各1 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O 8 μL。扩增ITS反应参数：94 ℃预变性 30 s;94 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环;最后 72 ℃延伸5 min，-20 ℃保存。扩增 nLSU 的 PCR 参数：96 ℃预变性 30 s;96 ℃变性 10 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35个循环;最后 72℃延伸 6 min，-20 ℃保存。取5 μL PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，确认目的片段单一且大小无误后将剩余的PCR产物送往华大基因有限公司进行核酸测序。通过NCBI网站的BLAST程序对所得序列分别进行同源比对分析。使用Phydit软件将本研究序列与其他比对序列的2个基因序列接拼合并后，用MEGA 7.0软件的自展法（Bootstrap）建系统发育进化树，进化树基于1000次重复检验所得。

2 结果与分析

2.1 迎春花叶枯病症状

迎春花叶枯病发病前期，叶片有褐色的不规则病斑，主要集中于叶缘及叶尖端，少量集中于中部，中期病斑蔓延至整个叶片使其枯萎并脱落，后期严重时该病沿维管束蔓延使枝条及前端20～30 cm处的所有叶片均出现病发症（图1-A，B，C）。

2.2 病原菌分离、培养及致病性测定

对迎春花病健交界处进行分离培养后获得5种不同的真菌菌株，编号分别为YC1-1， YC1-3，YC2-2，YC2-3，YC3-2。其中仅有YC1-1接种健康迎春花叶片在2 d后明显观察到有病斑出现（图1-E，G），5 d后的发病症状与自然发病症状相似（图1-F，H）。室外致病性实验7 d后叶片也出现了相同的病斑（图1-D）。依据柯赫氏法则，从发病的叶片再次进行分离，得到与接种菌株相同的菌物。因此，菌株YC1-1确为迎春花叶枯病的病原菌。

2.3 形态学鉴定

菌株YC1-1在PDA上的菌落中央为乳白色絮状，边缘为轮纹状，颜色较浅，菌丝稀疏（图2-A，D）。显微观察表明，初生菌丝薄壁较直，直径约1.5～3.5 μm，生殖菌丝细胞壁稍厚，分枝多，直径可达2.2～3.2 μm（图2-B， E）。担孢子由生殖菌丝上的担子产生，担孢子棍棒型至椭圆形，无色，薄壁，光滑，大小为4.3～6.0 μm × 2.4～3.1 μm（n=30）（图2-C，F）。根据形态学特征[16-18]，该病原菌初步鉴定为Phlebiopsis sp.。

2.4 分子生物学鉴定

将YC1-1的rDNA-ITS和nLSU基因序列分别上传至NCBI的GenBank数据库获得登录号（表1）。同时，利用NCBI中Blast程序对上述序列分别进行同源相似性比对分析，发现rDNA-ITS和nLSU序列分别与NCBI中的Phlebiopsis crassa菌株（菌株号He 5866）的rDNA-ITS和nLSU序列（登录号分别为：MT386376、MT447408）的相似度分别为99.67 %、99.93 %。从NCBI中分别下载与YC1-1亲缘相近的种的rDNA-ITS和nLSU序列，将2种序列合并后，以Phanerina mellea的相应序列合并后作为外群，采用MEGA 7.0软件构建ML（maximum likelihood）系統发育树。各参考菌株编号、地理分布及GenBank登录号如表1所示。结果显示YC1-1与P. crassa聚为1簇，bootstrap支持率为92 %（图3）。结合形态特征及分子鉴定结果，将迎春花叶枯病的病原菌鉴定为P. crassa，这是世界上首次报道Phlebiopsis crassa引起迎春花叶枯病。

3 结论与讨论

目前国内外关于迎春花病害的文章相对较少，仅Xu等[19]报道由植原体引起的迎春花丛枝病和方天露等[20]报道由果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）引起的迎春花枝条枯死，而未见叶枯病报道。本研究通过对病原菌YC1-1的致病性检测、形态学观察、以及分子生物学鉴定，明确引起迎春花叶枯病的病原菌为一种木腐真菌Phlebiopsis crassa。

木腐真菌主要存在于各种枯死的树干、倒木、及人工木制品上，通过分泌产生各种生物酶降解木材中的纤维素、半纤维素和木质素，在森林生态系统中起着关键作用，是生态系统重要的分解者。但同时它们也能引起林木病害，造成林业生产上的损失。林木腐朽真菌作为食用、药用、工业工程用等资源，也有着重要的经济价值。

P. crassa属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、平革菌科（Phanerochaetaceae）、Phlebiopsis属[16]。Phlebiopsis属目前共有19种，且在全球广泛分布[17]。木腐真菌能够以木材为生长基质，能将木材中的木质素、纤维素和半纤维素转化为自身可利用的营养物质，可使木材颜色发生改变，产生环状条纹，从而导致树木发生腐朽，对木材力学性能具有极大的破坏作用[21-23]。木材腐朽包括立木腐朽和木材腐朽2大类：立木腐朽作为病原菌寄生于活体树木上引起林木病害，造成林业损失;木材腐朽指生长在枯死的树干、倒木、及人工木制品上的腐朽菌，主要营腐生生活。除此之外，还有许多真菌属于兼性腐生菌和兼性寄生[24，25]，推测本研究中的P. crassa为寄生于迎春花上的病原菌。

本研究中的致病性实验接种P. crassa 病原菌3 d后，迎春花同样产生了环状条纹的病斑，并且在致病性试验中，可以发现经病原菌孢子液接种产生的病斑颜色呈黑色，而经病原菌菌丝块接种产生的病斑颜色呈黄褐色。根據Daniela等[26]关于水分含量变化对木腐真菌色素形成的研究中可以推测，孢子液中的水分可能使色素含量增加。

目前国内外尚未有关于P. crassa作为植物病害致病菌的报道，因此这是我国乃至全世界首次报道该菌在迎春花上引起的病害。调查发现，湖边、河边迎春花发病率较高，推测该病原菌在湿度较大环境下更容易使迎春花发病。

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