基于ISSR标记分析油梨种质的遗传多样性

摘 要：基于ISSR分子標记技术分析油梨种质遗传多样性和亲缘关系，旨在为油梨种质资源的合理利用提供科学依据。选用12条ISSR多态性引物对54份油梨种质的基因组DNA进行PCR扩增，利用Popgene 1.32、NTSYSpc 2.1软件计算遗传多样性参数、种质间的遗传相似系数以及UPGMA聚类分析。结果显示，筛选出的12条ISSR多态性引物共扩增出106条谱带，平均每条引物扩增8.08条多态性谱带，多态性位点比率PPB为91.83%，平均观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon’s信息指数（I）以及多态性信息量（PIC）分别为1.89、1.47、0.28、0.43、0.63。油梨种质间的遗传相似系数在0.66～0.91之间，在遗传相似系数0.72处，可划分为5大类群，供试种质并不完全按照地理来源进行分类。54份油梨种质有较高的遗传多样性，遗传信息丰富，ISSR标记对其多态性检测有效性高，适用于其遗传多样性分析。

关键词：油梨;种质资源;ISSR;遗传多样性;聚类分析

中图分类号：S-3                   文献标志码：A

Genetic Diversity Analysis of Avocado （Persea Americana Mill. ） Germplasms Based on ISSR Marker

ZHOU Hailan1，LI Shaopeng2，ZHOU Junan1，PANG Xinhua1，

OU Jingli1，PAN Zujian1，LI Juxin1，TANG Xiuguan1，Li Maofu2*

（1Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning， Guangxi 530001， China;

2College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan，Haikou 570228， China）

Abstract：To provide scientific basis for rational utilization of avocado （Persea Americana Mill.） germplasm resources， the genetic diversity and relatedness of 54 avocado germplasms were studied based on ISSR marker technology. 12 ISSR primers with rich polymorphism and clear amplified bands were used for PCR amplification of genomic DNA of the 54 avocado germplasm resources. The genetic diversity parameters and genetic similarity coefficients among germplasms were calculated， and UPGMA cluster analysis was carried out by using Popgene 1.32 and NTSYSpc 2.1 software. Results showed that a total of 106 bands were amplified from 12 ISSR primers with an average of 8.08 polymorphic bands per primer， and the percentage of polymorphic bands （PPB） was 91.83%. The average number of observed alleles （Na）， effective number of alleles （Ne）， Nei's gene diversity index （H）， Shannon's information index （I） and  polymorphism information content （PIC） were 1.89， 1.47， 0.28， 0.43， 0.63， respectively. The genetic similarity coefficients among avocado germplasms ranged from 0.66 to 0.91. Based on the results of cluster analysis， avocado germplasms could be classified into five groups at the genetic similarity of 0.72， and the tested germplasms were not completely classified according to geographical origin. The 54 avocado germplasms had high genetic diversity and rich genetic information. ISSR markers were effective for polymorphism detection and suitable for genetic diversity analysis of avocado germplasms.

Key words：Avocado; germplasm resources; ISSR marker; genetic diversity; cluster analysis

油梨（Persea americana Mill.）是樟科（Lauraceae）鳄梨属（Persea）植物，是世界许多热带和亚热带地区重要的经济和营养水果作物[1-3]。中美洲土著居民早在公元前8000年就食用了油梨，他们称其为“上帝的礼物”。油梨是一个高度多样化的物种，其地方性变异产生了不同的生态种[4]，主要为墨西哥种族（Persea americana Miller var. Drymifolia）、危地马拉种族（Persea nubigena Miller var. Guatemalensis）和西印度种族（Persea americana Miller var. Americana），种族间不存在不育障碍。油梨是一个二倍体物种 （2n = 2x = 24），属异型杂交植物，开花表现出独特的雌雄蕊异熟开放行为，有利于异花授粉，产生高度遗传杂交，为利用遗传变异进行育种提供了很好的机会。因此，无论是自然产生还是人工诱导，许多商业性油梨通常是不同种族的杂交种[5]。分子标记已被用于品种鉴定与分类、遗传多样性和进化研究、构建连锁图谱及标记辅助育种筛选目标性状等。分子标记已广泛用于调查油梨资源的遗传多样性。Fiedler等[6]利用RAPDs标记研究三个种族的16个油梨品种的遗传差异，有效地分离发现了种族特异性标记。Chen等[7-8]利用SNP标记对来自墨西哥、哥斯达黎加、厄瓜多尔和多米尼加共和国的21份野生油梨进行了核苷酸多样性研究。Guzman等[9]利用Gross-German和Viruel[5]之前使用的28个SSR标记，筛选了墨西哥国立油梨基因库的318个样本，根据他们的生态起源地区被分为两类。Boza等[10]用SSR标记对354株油梨树进行园艺种鉴定、居群结构与遗传多样性分析。

油梨于1918年首次被引入中国台湾省，迅速繁殖产生了许多具有理想特性的商业性优良品种。中国热带农业科学院、广西职业技术学院以及其他国有或私营农场已选育出十多个优质油梨品种。自20世纪50年代末以来，从美国、以色列、墨西哥和中美洲引入我国的油梨品种有上百种[11]。此外，油梨品种之间的自然杂交经常发生，产生了许多新的油梨杂交种，在进化过程中产生了丰富的遗传多样性。已有的研究报道用分子标记对油梨种质进行遗传多样性研究涉及到的数目有限，广泛性有待进一步研究。简单重复序列区间扩增多态性（ISSR）是在SSR标记上创建，植物基因组中ISSR序列普遍存在。本研究采用ISSR标记对油梨种质资源圃内的54份油梨种质进行多态性研究，评估油梨种质间的遗传多样性，为管理核心种质、遗传改良及拓宽油梨育种材料提供理论基础，提高育种效率。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料选用与周海兰等[12]相同（见表1）。试验所用的引物序列是加拿大哥伦比亚大学公布的第九套 ISSR 引物序列，编号为UBC801～900，共100条，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。Taq酶、dNTPs等试剂药品均从TAKARA公司购买。主要仪器设备：PCR仪（Eppendorf Mastercycler Pro S，德国），琼脂糖水平电泳仪（Standard Power Pack P25，德国），核酸蛋白仪（Nanovue plus超微量分光光度计，英国），紫外凝胶成像系统（DBT-2000W，泰亚赛福）等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

选取供试材料健康无病害的干净嫩叶，采用改良2×CTAB法[13]提取嫩叶DNA，并用核酸蛋白仪检测DNA的浓度和纯度，获得的DNA放置-20℃保存备用。

1.2.2 ISSR引物筛选及PCR扩增

以表型差异明显的哈斯、大岭 7 号、福尔特及巴康4个油梨种质嫩叶DNA为模板对100条ISSR引物进行多态性筛选。ISSR-PCR的反应程序采用TD-PCR扩增程序：94 ℃，预变性3 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s（-1 ℃/循环），72 ℃延伸1 min，20个循环;94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20个循环;72 ℃延伸10 min;4℃终止。ISSR-PCR反应体系为：在20 μL的反应体系中，2X PCR buffer 2 μL;dNTPs（2.5 Mm）2 μL;MgCl2（25 Mm）1.6 μL;rTaq酶 0.2 μL;引物（10 μM）0.8μL;DNA模板（20 ng）2 μL;ddH2O补足至20 μL。用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测PCR产物，在120 V恒电压下，电泳40 min，拍照保存，统计分析电泳条带。

1.3 数据统计分析

观察凝胶电泳图，同一条引物的扩增产物，相对迁移率相同的为1个位点，统计扩增条带时，按同一位点有无条带进行1、0赋值，有带（阳性）记为1，无带（阴性）记为0，在Excel录入数据，形成（1、0）数据矩阵。统计总扩增条带数、多态性条带数、多态性条带比率（Percentage of polymorphic bands，PPB）和多态性信息含量（Polymorphism information content，PIC）。多态性信息含量根据公式PIC = 1 - ∑ Pi 2計算，Pi表示第i种基因型出现的频率[14]。采用Popgene 1.32进行遗传多样性参数分析，计算观测等位基因数（Observed number of alleles，Na），有效等位基因数（Effective number of alleles，Ne）、Nei’s基因多样性指数（Nei's gene diversity，H）、Shannon’s信息指数（Shannon's Information index，I）等。NTSYSpc 2.1软件对统计数据进行遗传相似系数计算和UPGMA法聚类，分析54份油梨种质的亲缘关系和遗传多样性。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

降落PCR（Touchdown PCR）程序省去了大量引物退火温度的摸索，减少非特异性带的产生，提高筛选效率。试验以4个油梨样品的DNA为模板，从100条ISSR引物中选出12条扩增条带清晰、稳定性好的多态性引物用于油梨种质的ISSR遗传多样性分析，见表2。

2.2 遗传多样性分析

采用经筛选出的12条ISSR多态性引物对54份油梨基因组DNA进行ISSR扩增（图1），统计结果见表3。每条引物扩增产生条带4-13条，共产生条带106条，其中每条引物产生的多态性条带在3～12条之间，共97条，占总条带的91.51%（多态性条带比率PPB），多态性较好。每条引物的多态性信息量（PIC）为0.52～0.76，平均为0.63，观测等位基因数（Na）的变化范围为1.67～2，平均1.89，有效等位基因数（Ne）的分布范围为1.24～1.65，平均为1.47，Nei’s基因多样性指数（H）变化范围为0.17～0.37，平均0.28，Shannon’s信息指数（I）变化在0.28～0.55之间，平均0.43，表明筛选获得的12条ISSR引物的综合表现较好，适合进行油梨种质亲缘关系和遗传多样性评价，可以作为一种工具来区分不同来源的基因型。

2.3 聚类结果

UPGMA聚类结果显示，所有个体的遗传相似性系数在0.66～0.91之间。相似系数为0.72时，UPGMA分析将群体分为5类（图2）。在第一类（A）中，将来自云南的5份种质（YN003、YN011、YN022、YN027、YN028）和广西的4份种质（Hass、桂研10号、桂肯大2号、桂垦大3号）及海南的35份种质（DKM、Pollock、大岭2号、大岭3号、大岭4号、大岭5号、大岭8号、大岭10号、大岭11号、大岭12号、大岭13号、大岭14号、大岭15号、大岭17号、芙蓉田1号、芙蓉田2号、芙蓉田3号、芙蓉田4号、芙蓉田5号、芙蓉田6号、芙蓉田7号、芙蓉田8号、芙蓉田9号、热研2号、热研3号、热研16号、大岭6号、大岭9号、大岭16号、Y2-12、Y3-1、Y3-23、Y6-5、Y7-20、Y10-1）进行了分组，归为A类，共44份种质，占供试种质的81.48%。第二类（B）包括3个来自海南的种质，为大岭7号、热研17号、Y1-10。第三类（C）为来自广西的Fuerte、Bacon。第四类（D）为来自云南的4份种质（YN005、YN010、YN016、YN020）。第五类（E）来自云南的1份种质YN006。表明这些供试种质并不完全按照地理来源进行分组。另一方面，需要指出的是，在类群中，基因型间的遗传相似性最大的为种质7（大岭2号）和种质21（芙蓉田3号）、种质9（大岭4号）和种质10（大岭5号）。

3 讨论与结论

油梨在我国越来越受欢迎，在热带和亚热带地区如广西、海南、云南、贵州、广东、福建和台湾等南方省份广泛种植与使用。油梨种质资源的多样性是油梨改良工程的重要组成部分，在当前选育油梨品种的过程中，需要一个高度多样化的基因库，以增加产量、提高果实品质、抗病虫害及改善含油量等，而关于我国油梨遗传多样性背景的研究很少。本研究以从广西、云南、海南收集的油梨种质资源为研究对象，利用ISSR分子标记阐明54份油梨种质资源间的亲缘关系，为我国油梨种质资源的改良育种提供参考。

本研究采用ISSR标记对54份油梨种质资源进行亲缘关系和遗传多样性分析，结果显示，所有个体的遗传相似系数在0.66～0.91之间，在相似系數为0.72时，供试种质分成5个类群，与前面研究油梨遗传多样性的SSR分析[12]分成4个类群存在差异，但大多数供试种质能聚为一类群，聚类结果整体上表现一致。本研究的供试种质在相似系数为0.72时，划分为5个类群：聚为A类群的有44份油梨种质，包括来自云南的5份、广西的4份及海南的35份;B类群为来源于海南的3份种质;C类群为来源于广西的2份种质;D类群为来自云南的4份种质;E类群来自云南的1份种质。可见，A类群的种质不完全按照地理来源分类，国内的油梨种质最初由海外引进的，经过种子和芽条的传播和繁殖散布到南方多省的热带亚热带区域，这可能造成了在A类群来自不同地区的种质遗传背景相似性高的原因之一。然而，B类群、C类群、D类群及E类群是完全按照地理来源分类的，且油梨种质资源的遗传背景与地理分布有一定的相关性，来源于同一地区的种质资源遗传变异较小。综合表明，分为5个类群的供试油梨种质并不存在完全的地理来源的聚类，且在一定程度上体现了供试种质地理来源的相似性。

多态性信息量（PIC）是评估基因变异程度的主要指标之一。本研究中利用12条ISSR多态性引物对54份油梨种质资源进行遗传多样性分析，PIC平均值为0.63，PIC大于0.5，表明位点具有高度多态性。Cuiris-Pérez H等[14]利用7个ISSR分子标记对77份油梨种质资源的遗传多样性、种质鉴定的研究中，PIC均值为0.92远高于本研究，墨西哥作为油梨原产地，相对来说油梨种质资源基因型更丰富多样，群体遗传多样性也相对较高。此外，在亲缘关系密切的油梨个体中，与油梨的其他分子标记研究结果一样[15-18]，ISSR标记检测遗传变异的有效性在本研究中得到了证实，研究中没有发现供试的油梨种质资源之间遗传相似系数为1，各种质不存在重复收集，供试种质存在广泛的遗传变异，均可保存起来用于选育种，表明ISSR可以作为一种工具来区分不同来源的基因型。然而，本研究中ISSR标记检测到的位点没有关联农业形态特征，这种联合研究在加速育种过程中很重要，值得在后续的研究中考虑。

综上所述，本研究证明了ISSR标记在油梨遗传多样性分析中的应用价值，检测到的高多态性位点可为油梨基因组学、育种和选择提供分子标记材料来源，未来的工作重点是研究油梨形态和发育多样性的进化，为油梨的育种和选择提供新的依据。

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