引起生姜块茎腐烂病原菌的分离与鉴定

张莞苓，薛雅蓉，郭雨，左广胜，刘常宏

（1.南京大学生命科学学院，江苏南京 210023；2.北京中龙创科技有限公司，北京 100071）

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是姜科姜属多年生草本植物，也是重要的药食两用经济类蔬菜作物，在亚洲、非洲、南美洲等地区都有栽培。我国是生姜主产国之一［1］，主产区在山东、河南、四川等省［2］，是种植区农业经济的支柱作物，且具有很高的出口创汇价值。生姜块茎腐烂等病害的连年发生严重影响了生姜的产量和品质，造成巨大的经济损失［2-4］。分离并鉴定引起生姜块茎腐烂的病原菌并有针对性的防治，是控制该病发生的根本方法。

已报道的引起生姜块茎腐烂的病原菌主要有青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）［5］、欧文氏菌（Erwinia spp.）［6］、短 小芽 孢杆 菌 （Bacillus pumilus）［7］、群 结 腐 霉 菌 （Pythium myriotylum）［8，9］和 尖 孢 镰 刀 菌 （Fusarium oxysporum）［10，11］。由于地理环境及气候差异，这些病原菌在各地的分布不尽相同，并且还可能存在尚未发现的新病原菌。

山东为我国生姜种植面积最大的省份，2019年种植面积10.15万公顷，占北方生姜种植总面积（11.39万公顷）近90%，超过全国生姜种植总面积（28.43万公顷）的 1／3［12］，在我国生姜种植产业和生姜产品供应体系中有着举足轻重的地位和作用。为了解引起山东省潍坊市生姜种植区生姜块茎腐烂的原因，本试验从潍坊市多地生姜种植田采集腐烂块茎，进行病原菌的分离与鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

腐烂生姜块茎：于2017年8月（生姜大培土期）采自山东省潍坊市青州朱家埠村（QZ）、安丘凌河镇马家河崖头村（AQ）、昌邑北孟镇上坡村（CY）、昌乐红河镇王家埠村（CL）生姜栽培区发病地块（发病率超过60%），生姜茎叶严重失绿黄化、根茎腐烂。

细菌分离培养基：LB琼脂培养基。

真菌分离培养基：含0.5 mg／mL的硫酸链霉素和氯霉素的PDA培养基。

1.2 病原菌的分离

清洗发病生姜；75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗3次；3%的次氯酸钠消毒15 min，无菌水冲洗3次；灭菌滤纸吸干表面水分。用无菌刀片将病健交界处组织切成0.5 cm ×0.5 cm ×0.1 cm大小，分别放于固体 LB（37℃，24 h）和 PDA（28℃，5 d）培养基上培养，待菌落长出后进行纯化，并对纯培养物进行常规保种。

1.3 病原菌的鉴定

根据菌落及菌丝形态观察，结合基于细菌16SrDNA（引物：27F／1492R）和真菌 ITS（引物：ITS1／ITS4）的特异性 PCR扩增产物的测序结果［8］，确定引起生姜块茎腐烂的病原菌分类地位。

1.4 接种体的制备

细菌菌悬液的制备：挑取纯化细菌单菌落，接种至LB液体培养基，37℃、150 r／min培养24 h；4 000 r／min离心5 min收集细菌，用PBS缓冲液重悬并调菌悬液浓度至3×108cfu／mL，用于致病性接种试验。

真菌菌饼的制备：挑取少量菌丝于PDA平板上，置于28℃恒温箱黑暗培养5 d，沿菌落边缘用直径为5 mm的灭菌打孔器打取菌饼。

真菌孢子悬液的制备：参照黄福新等［13］的方法。将真菌接种在PDA培养基上，25℃黑暗培养10 d；在超净工作台内将菌丝刮入无菌水中，搅拌后用无菌纱布过滤除去菌丝；滤液用无菌水调孢子悬液浓度为1×105个／mL。

1.5 致病性试验

按照1.2的方法消毒健康生姜块茎表面，然后将其横切成厚度约1 cm的姜片；向其表面涂布细菌菌悬液（以涂布无菌水为对照）或接种真菌菌饼（以接种PDA固体培养基为对照）；将涂布有细菌和无菌水的姜片置37℃黑暗培养48 h，将接种真菌菌饼和PDA固体培养基的姜块置30℃封闭保湿培养5 d。肉眼观察生姜块茎的腐烂情况，检测所接种细菌或真菌对生姜块茎组织的致病性。进一步分离鉴定腐烂块茎组织中的病原菌，检查其与原接种菌的一致性。

1.6 盆栽试验

按照1∶10（V／W）的比例，将病原细菌菌悬液或病原真菌孢子悬液混入灭菌营养土中，同时设置接种等体积的无菌水为对照，搅拌均匀后装入花盆中，播种1块健康生姜块茎，每处理共5盆，于光照培养箱中培养，观察生姜生长及发病情况。56 d后刨出生姜块茎，用无菌水冲洗干净，观察生姜块茎腐烂情况，并统计生姜植株叶片数、株高、茎围、茎叶鲜重与块茎鲜重。

1.7 数据处理与分析

采用Graphpad Prsism 6软件进行Duncan’s检验（P＜0.05）；采用Mega 10构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 引起生姜块茎腐烂病原菌的分离与鉴定

根据菌落形态和基因序列分析，从20个腐烂块茎中共分离获得10株细菌和3株真菌（表1）。

利用生姜块茎切片接种技术，评估了分离获得的细菌和真菌菌株引起健康生姜块茎腐烂的能力，发现只有2株细菌（E4，E17）和1株真菌（F01）能够引起健康生姜块茎组织病变（表1，图1），分别占总细菌种类的20.0%和总真菌种类的33.3%。从发病组织中能够重新分离获得相同的病原菌，因此，E4、E17和F01鉴定为引起生姜块茎腐烂的病原菌，并且在山东潍坊市的青州（QZ）、安丘（AQ）、昌邑（CY）和昌乐（CL）等地来源的腐烂生姜块茎中普遍存在（表1）。

E4菌株在LB培养基上的菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，不透明，边缘整齐，有黏性（图2A）。显微镜观察显示，E4菌株呈短杆状，大小（1.3～1.5）μm ×（0.7～0.9）μm，两端钝圆，中生芽孢，无鞭毛和荚膜、革兰氏阳性（图2B）。16SrRNA基因序列相似性分析（表1）及系统发育树（图3）显示，E4菌株与短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）亲缘关系最近。综合形态学和基因序列分析，鉴定E4菌株为短小芽孢杆菌。

表1 病姜块中分离到的病原菌、分布及侵染性

图1 病原菌（E4、E17、F01）引起生姜块茎腐烂症状

图2 E4菌株的菌落和菌体形态

图3 E4菌株的系统发育树

E17菌株LB培养基上的菌落呈圆形，表面光滑，湿润有黏性，边缘整齐，产生可扩散的水溶性绿色色素（图4A）。菌体革兰氏染色呈阴性，杆状，两端钝圆（图4B）。16S rRNA基因序列相似性（表1）和系统发育树（图5）分析表明，E17菌株与铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）亲缘关系最近。综合形态学和基因序列分析，鉴定E17菌株为铜绿假单胞杆菌。

图4 E17菌株的菌落和菌体形态

图5 E17菌株的系统发育树

F01菌株在PDA培养基上生长良好，气生菌丝为白色絮状或绒毛状；培养初期，菌落为白色，中间以辐射状出现淡紫红色，背面产生深紫红色色素；菌株气生菌丝茂盛，菌丝浓密，质地厚实（图6A）；大型分生孢子呈镰刀形，两端渐尖，基细胞足状，多数3个分隔，少数4～7个分隔，大小为（20.5～56.7）μm ×（3.0～6.3）μm（图6B）；分生孢子梗呈瓶颈状，小型分生孢子较多，呈卵形或椭圆形，0～1个分隔，大小为（5.2～16.8）μm ×（2.1～5.0）μm；厚垣孢子间生或顶生，球形或椭圆形，壁光滑（图6C）。ITS序列相似性分析（表1）和系统发育树（图7）表明，F01菌株与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的亲缘关系最近。

图6 F01菌株的菌落特征及孢子形态

2.2 盆栽试验结果

盆栽试验结果表明，接种病原菌E4、E17和F01菌株56 d后，生姜长势极差（图8A）。刨出生姜块茎后发现，3种病原菌均可致生姜块茎100%发生褐变，以接种E17菌株引起的褐变最为严重（图8B）。该结果进一步表明E4、E17和F01菌株均为引起生姜块茎腐烂的病原菌。

由表2可知，E4、E17和F01菌株侵染后，生姜的叶片数、株高、茎围、茎叶鲜重和块茎鲜重均显著低于对照，但不同病原菌对生姜生长的危害程度差异不显著（P ＞0.05）。

表2 不同病原菌对生姜生长的影响

图7 F01菌株的系统发育树

图8 不同病原菌对生姜块茎及植株生长的影响

3 讨论与结论

通过对山东省潍坊市多地生姜腐烂块茎中病原菌的分离、鉴定及致病性评价，共获得10株细菌3株真菌，其中，2株细菌（短小芽孢杆菌E4和铜绿假单胞杆菌E17）和1株真菌（尖孢镰刀菌F01）为引起生姜块茎腐烂的病原菌。

已有报道显示，短小芽孢杆菌和尖孢镰刀菌为引起莱芜区生姜块茎腐烂的病原菌［7，10］。本研究发现，该两种病原菌在潍坊生姜种植区也普遍存在，表明短小芽孢杆菌和尖孢镰刀菌可能是导致生姜块茎腐烂的重要病原菌。

铜绿假单胞杆菌在自然界分布广泛，是土壤常见细菌之一，可引起黄瓜细菌性白枯病［14］和烟草细菌性叶斑病［15］等病害。迄今未见其作为引起生姜块茎腐烂病原菌的报道。本次从生姜腐烂块茎内分离到该菌，姜块组织及盆栽试验均显示其能够引起生姜块茎腐烂，植株生长受阻，是一种新的生姜块茎腐烂致病菌。该研究结果对于研发针对铜绿假单胞杆菌的新型杀菌剂或优化原有登记农药配方和使用技术［16，17］，确保生姜健康栽培有重要的参考价值。

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