维生素K2 通过降低D-双功能蛋白活性抑制肝癌的实验分析

王佳 赵卿

肝癌作为常见癌症之一,其发病率和致死率均比较高,调查研究资料显示,目前该病发病率在全球前三位。有报道研究指出,维生素在血液凝固中有着非常重要的作用,特别是对心血疾病、骨骼健康［1］。也有研究表示,维生素K 在肿瘤形成以及生长中具有抑制功效,特别是维生素K2［2］。本文就维生素K2通过降低DBP 活性抑制肝癌的效果进行讨论分析。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 根据研究要求,将人源肝细胞HepG2细胞分为过表达DBP 组(A 组)、空载体质粒对照组(B 组)、敲低D-双功能蛋白组(C 组)、对照小干扰RNA 组(D 组)。其中A 组和C 组分别使用0～100 μmol/L不同浓度的维生素K2进行处理。

1.2 实验方法 把HepG2 细胞接种至孔板中进行培养,温度为37℃,CO2浓度为5%,当细胞生长到70%融合度时予以转染。根据转染试剂使用要求,将质粒、小干扰RNA 分别溶解在没有血清、抗生素的RPMI1640 培养液中将其混合均匀。将脂质体Lipo-fectamine2000TM 溶解在没有血清与抗生素的RPMI1640 培养液中混合均匀,在室温放置5 min。把上述转染试剂分别和脂质体混合均匀,在室温放置20 min。而后弃去孔板中原有培养基,且利用新鲜没有血清和抗生素RPMI1640 的培养基对细胞进行洗涤2次。把各组脂质体以及质粒混合液滴入到每孔细胞中,放置在37℃环境中进行培养。6 h 后更换含有10%胎牛血清的培养基,培养48 h 后用于后面的实验。

经过处理的细胞在蛋白提取、蛋白定量后借助裂解液稀释成浓度为5 μg/μl 的悬液,而后加上5×上样缓冲液在95℃条件下煮沸5 min。制作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),实施蛋白上样以及凝胶电泳,经电泳把蛋白胶转导聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜),利用5%脱脂奶粉实施封闭,而后分别加入兔抗人DBP 以及β-actin 抗体,将其放入4℃冰箱温育,同时TPBS 洗膜,使用荧光二抗在室内静置孵育大约1 h,再用TBST洗膜2 次,时间10 min,最后借助于Odys-sey 发光扫描。根据说明书把CCK-8 试剂和无血清的RPMI1640培养基按照比例1∶4 混合,接着把转染后培养了48 h的96孔板中培养基去除,在每孔中添加CCK-8混合液,剂量为100 μl,放置在37℃及5%CO2下进行培养,时间4 h,而后借助酶标仪于450 nm 位置读取吸光度值。采取Western-blot 进行DBP 表达变化的检测,通过CCK进行细胞增殖能力的检测,结果以相对吸光度值表示。经放射免疫进行E2水平的分析测定,根据E2放射免疫试剂盒说明书,取8 个试管,将其做好标记,根据试剂盒说明书上的要求,分别添加稀释缓冲液,将其充分混匀,放置扎37℃,在1.5 h 后添加添加分离剂进行充分混匀,在4℃、3600 r/min 条件下离心20 min,去除上清液,以γ 计数仪对各管放射性活度强度进行测定。取待测定的培养基来代替标准品,添加标记物和抗体进行混匀,放置在37℃1.5 h 以后添加分离剂进行混匀,在4℃、3600 r/min 条件下进行离心,时间20 min,去除上清液,测定E2含量。结果以每毫升样品含有E2的量(ng/ml)表示。

1.3 观察指标 分析DBP 表达对肝癌HepG2 细胞增殖、E2水平的影响；不同浓度维生素K2对肝癌细胞增殖、E2以及DBP 表达产生的影响。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t 检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DBP 表达对肝癌HepG2 细胞增殖、E2水平的影响 A组HepG2细胞增殖明显高于B组,D组高于C组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。经Western 实验,DBP过表达质粒、干扰RNA 对HepG2 细胞进行转染以后,可对DBP 表达进行干预。通过CCK-8 实验发现,DBP过表达以及敲低可相应的增加或者减少细胞数量。A 组E2水平低于B 组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。DBP过表达使细胞E2分泌水平下降。见表1。

表1 四组HepG2 细胞增殖、E2 水平比较(±s)

表1 四组HepG2 细胞增殖、E2 水平比较(±s)

注：与B 组比较,aP＜0.05；与C 组比较,bP＜0.05；“-”表示无数据

2.2 不同浓度维生素K2对肝癌细胞增殖、E2以及DBP 表达产生的影响 经CCK-8 实验分析发现,和B 组比较,A 组HepG2 细胞增殖明显加强,在分别使用不同浓度的维生素K2处理2 d 后,细胞增殖表现为依赖性下降。采用小干扰RNA 敲低DBP 的表达后,细胞增殖显著下降,但是维生素K2的处理对其细胞增殖产生的影响不是很大。采用不同浓度维生素K2对B 组、A 组HepG2 细胞进行处理2 d 后,对培养基的E2水平进行检测,经检测发现当维生素K2剂量不断上升时,培养基中E2水平也会相应上升。采用浓度100 μmol/L维生素K2对B 组、A 组HepG2 细胞进行处理后,DBP蛋白表达变化不显著。

3 讨论

肝癌一般分为原发性与继发性,其中原发性肝癌起源于肝脏上皮组织或者间叶组织,原发性肝癌目前在国内属于高发疾病,危害非常大；继发性肝癌又叫做肉瘤,和原发性肝癌相比在临床中比较少见。继发性或称之为转移性肝癌,是指全身多个器官所致恶性肿瘤侵犯到肝脏。通常见于胃、子宫、乳腺、胆道、肺、胰腺、子宫、结直肠以及卵巢等器官恶性肿瘤的肝转移。原发性肝癌病因和确切分子机制目前还不清楚,多认为该病的发生是多因素和多步骤的一个复杂过程,不仅受环境的影响,同时也受饮食的影响。目前大量实验研究资料和流行病学表明,肝硬化、乙型肝炎病毒感染、微量元素、丙型肝炎病毒感染、酒精、黄曲霉素、亚硝胺类物质、饮水污染以及性激素等均和肝癌的发生有关。继发性肝癌可经不同途径(比如淋巴液转移、血液转移或者直接浸润而形成疾病)。原发性肝癌早期肝癌症状无特性,一般中晚期肝癌症状表现比较多,多为肝区疼痛、上腹部包块、腹胀、消瘦、纳差、进行性肝大、乏力等,部分患者可能出现上消化道出血、低热、腹泻以及黄疸等,肝癌破裂以后还可能会出现急腹症表现等,也有部分患者症状表现不是很明显,可能会出现转移灶症状。

肝癌恶性程度相对比较高,不管是发病率还是病死率均比较高,同时手术预后比较差,关于其发病机制以及靶向治疗方面的内容现已得到很多医学研究人员的关注。维生素K2属于脂溶性维生素,作为人体中不可或缺的一种重要维生素,通常经一些生物合成技术合成,维生素K2多数存在于发酵的食物中,在日常生活中有很多的人都缺乏该维生素。维生素K2作为维生素K 唯一具备生物活性的一种形式,一般用于加速凝血、治疗维生素K 缺乏所致出血症以及维持凝血时间等,该药对人体的功能多体现于骨质疏松的预防以及治疗,不仅具备保健功效,同时还具备药用功效。和维生素K1相比较,维生素K2所具有的抗骨质疏松作用很是明显,有利于骨矿化,骨钙素可促进钙盐沉积,使骨矿化速率上升,以此维持骨正常钙化与结晶形成,直接反映骨形成以及骨重建。维生素K2作为骨特异基因转录调节剂,经类固醇与异质物受体诱导成为骨细胞标记物的表达,提高胶原蛋白蓄积功效,改善骨质量。维生素K2对于软骨、血管钙化还具备强烈抑制功效,可清除异常钙斑。有研究报道表示,骨质疏松、血管硬化以及骨关节炎等相关疾病都有一个相同致病因子,即缺乏维生素K2。此外,相关报道表示,维生素K2可抑制多种肿瘤细胞增殖,经负调控和细胞癌变相关的磷酸酯酶活性、酪氨酸激活性,调节和细胞增殖有关的各种调控因子,以此抑制细胞周期或者使细胞死亡［4］。DBP 属于氧化还原代谢酶,可促进雌二醇脱去氢离子丧失活性,故生物体内雌二醇量变化可当做DBP 活性上升减少的一个重要指标。相关研究报道表示,DBP 于肝癌HepG2 细胞中显著高表达,可使E2表达水平下降继而进一步促进肝癌细胞的增殖。另外由于肝癌中DBP 表达和肿瘤标志物的表达相关性比较好,故在肝癌的诊断以及治疗中可将DBP 作为新靶点。有学者发现HepG2 细胞内维生素K2能够和DBP 相结合以此影响其活性,故维生素K2很有可能通过与DBP 的互相作用而使其活性下降,同时E2水平上升,以此发挥抑制肝癌细胞增殖的功效［5］。以往相关报道研究指出,人源肝癌组织中DBP 表达处于高水平状态时,肝癌HepG2 细胞中DBP 表达上升会使E2水平表达下降,继而造成癌细胞增殖基因中的cyclinD1 和增殖细胞核抗原(PC-NA)等表达显著上升,这些最后均会使肝癌细胞增殖［6］。本次研究发现,维生素K2和DBP 之间互相作用使得DBP 活性下降,继而造成细胞内E2水平明显增加,从而抑制了肝癌细胞增殖。

综上所述,维生素K2可抑制肝癌细胞增殖,维生素K2通过与DBP 互相作用,使得DBP 活性下降,E2表达水平上升,以此抑制肝癌细胞增殖。