大黄的炮制对生大黄、熟大黄5种游离蒽醌含量的影响测定*

张 如，魏江存，马家宝，杨正腾△，王成龙

1广西壮族自治区妇幼保健院，广西 南宁530003；2广西国际壮医医院；3广西中医药大学第一附属医院

大黄属中药泻下药，始载于《神农本草经》，为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.，唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinaleBaill.的干燥根和根茎［1］。掌叶大黄和唐古特大黄被称为“北大黄”，主产于青海、甘肃等地；药用大黄称为“南大黄”，主产于四川、陕西等地［2］。我国有45个品种和2个亚种的大黄，但2015版《中华人民共和国药典》只收录3种大黄，即正品大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根及根茎，主要有效成分有芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、没食子酸、番泻苷类、鞣质、大黄多糖和微量元素等成分［3-4］。大黄性苦、寒，归脾、胃、大肠、心、肝经，其药理作用非常广泛，如：泻下、消炎、抗菌、抗病毒、利胆、止血、降血脂、降血压等［5-6］。

炮制是提高中药临床疗效的重要手段，炮制后药物药性改变，成分变化［7-13］，根据辨证施治的需要，合理选用不同的炮制品，才能提高中药的疗效，减少毒副作用［14-16］。临床应用大黄时除了使用生品外，也常使用炮制品，其中以生大黄、熟大黄、酒大黄、大黄炭最为常用，2015版《中华人民共和国药典》收载有生大黄、酒大黄、熟大黄、大黄炭4种炮制品。

中药大黄含有多种有效成分，在加热蒸炒炮制过程中，其所含有效成分含量变化很大，药效也随之发生改变［9，12］。笔者采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）同时测定生、熟大黄中5种游离蒽醌成分，为综合评价大黄不同炮制品质量提供了方法。

1 材料

1.1 试药与试剂芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚（纯度＞98%，上海融禾医药科技有限公司，批号：160520、170219、170224、160124、160602）；甲醇（美国Fisher科学世界公司，色谱纯）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；乙醇（国药集团化学试剂有限公司；分析纯）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器Waters 2695型高效液相色谱仪（包括2489UV，四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱和Empower3液相工作站）；纯水仪（法国，密理博）；PRACTUM224-KN SOP型电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；TGL-16G型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；HWS-26型电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；45 μm微孔滤膜。

1.3 大黄的炮制工艺

1.3.1 生大黄［17-19］取原药材除杂，大小分开，清洗干净，用清水浸泡约六成透，捞出，焖润到内外湿度一致时，切成片，晾干或烘干，筛去碎屑即可。现代研究表明，大黄中结合性大黄酸苷类等泻下成分煎煮10 min左右，煎出量最高，久煎后多被破坏。故生大黄片用于泻下时，应后下，且煎煮时间不宜长，否则泻下作用减弱。见图1。

1.3.2 熟大黄［18，20］将大小分档的洗净大黄片用黄酒拌匀，焖润至黄酒全部被吸尽，放入蒸制容器内密闭，置水锅上武火加热蒸4～6 h（注意随时加水，避免干锅）至大黄内外均呈黑褐色时取出，晒干或烘干。大黄∶黄酒=100∶0～30。生大黄片经蒸熟后，它的泻下及收敛作用明显减弱，作用比较缓和；在炮制过程中，产生较多的大黄素等，增强其清热解毒的作用。临床上一般用于热毒引起的火毒疮疡等症。见图2。

图2 熟大黄

2 方法与结果

2.1 色谱条件使用Thermo BDS HYPERSIIC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相甲醇-0.1%磷酸（85∶15），检测波长256 nm，流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量10 μL，按照上述条件各组分分离度良好。见图3。

图3 大黄混合对照品及生、熟大黄供试品的HPLC色谱图

2.2 对照品溶液制备1）分别精密称取芦荟大黄素12.94 mg，大黄素12.69 mg，大黄酸14.34 mg，大黄酚12.33 mg，大黄素甲醚13.67 mg，分别加入甲醇使之溶解，芦荟大黄素和大黄素分别定容至25 mL容量瓶中，大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚分别定容至10 mL容量瓶中，即得各对照品储备液。2）分别精密量取芦荟大黄素和大黄素对照品储备液1 mL，大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚对照品储备液3 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，即得混合对照品溶液，即芦荟大黄素20.7 μg/mL，大黄酸172.1 μg/mL，大黄素20.3 μg/mL，大黄酚148.0 μg/mL，大黄素甲醚164.0 μg/mL。

2.3 大黄供试品溶液制备分别取大黄不同炮制品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察分别精密吸取大黄混合对照品溶液1、2、5、8、12、15、20 μL注入液相色谱仪，各进样1次，测定峰面积，分别以峰面积和进样量（μg）为纵坐标和横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。精密吸取上述大黄蒽醌类混合对照品稀释液，进样，测定其信号（以峰高计算）与噪声比值，将S/N=3时的浓度定为检测限（LOD），将S/N=10时的浓度定为定量限（LOQ）。可得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚回归方程式分别为：Y=5.0×106X-21952（r=0.9999），Y=3.0×106X-352285（r=0.9996），Y=4.0×106X-19323（r=0.9998），Y=6.0×106X-324544（r=0.9999），Y=850954X-64874（r=0.9993）；分别在0.0207～0.414、0.1721～3.442、0.0203～0.406、0.148～2.96、0.164～3.28线性范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验精密量取混合对照品溶液适量，按“2.1”项下条件连续进样6次，分别记录各自的峰面积，并计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD（%）。结果测得混合对照品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD值分别为0.70%、0.70%、0.37%、0.35%和0.42%，RSD都小于3.0%，表明所用液相色谱仪的精密度良好。

2.6 稳定性试验取大黄粉末0.5 g，精密称定，按“2.3”项下的方法制备成供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下条件依法测定各供试品的峰面积，结果测得生大黄中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.62%、0.34%、0.29%、0.19%、0.21%；熟大黄中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.93%、0.14%、0.13%、0.19%、0.22%。RSD都小于3.0%，说明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.7 重复性试验精密称取生大黄和熟大黄药材粉末0.5 g，精密称定，每种炮制品均称取6份，按“2.3”项下的方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下条件依法测定各供试品的峰面积，计算生大黄和熟大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量，结果测得生大黄中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚平均含量分别为1.7794、5.1054、2.5204、5.3456、5.8814 mg/g；熟大黄中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均含量分别为1.8396、4.8026、2.6820、6.7914、7.4956 mg/g；生大黄的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的RSD分别为0.54%、0.90%、0.86%、0.54%、1.03%；熟大黄中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚测的RSD分别为1.35%、0.69%、0.57%、0.80%、0.69%。RSD都小于3.0%，表明该方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验精密称取大黄药材粉末0.25g，精密称定，共9份，分成3组，即低、中、高加样组（0.25g药材含量的80%、100%和120%加样），每组分别加入混合对照品溶液（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚），按“2.3”项下的方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下条件测定，计算生大黄低、中、高加样组中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率和其RSD值。结果见表2—3，表明该方法准确性良好。

表2 生大黄加样试验结果

续表2

表3 熟大黄加样试验结果

续表3

2.9 样品含量测定分别称取大黄不同炮制品药材粉末（过2号筛）0.5 g，各3份，精密称定质量，按“2.3”项下的方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下条件测定，采用外标一点法计算大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。见表4。

表4 生、熟大黄含量测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择本试验采用HPLC测定大黄游离蒽醌，对其流动相进行了选择，发现流动相中加入不同种类的酸对5种游离蒽醌的分离有很大的影响。本试验采用甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）、甲醇-0.2%磷酸溶液（85∶15）、甲醇-0.1%冰醋酸溶液（85∶15）、甲醇-0.2%冰醋酸溶液（85∶15）和甲醇-0.1%冰醋酸溶液（85∶15）等流动相选择试验比较，认为以甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）作为流动相，大黄5种游离蒽醌分离效果较好，与杂峰达到基线分离。因此认为本法快速、重复性好、稳定，可用于大黄炮制原理、工艺、质量等研究。

3.2 含量变化分析生大黄用黄酒拌匀，焖润至黄酒全部被吸尽，放入蒸制容器内密闭武火加热蒸制后，其5种游离蒽醌与生品大黄相比含量有所变化，根据以上的含量测定结果表明，芦荟大黄素含量下降约8.26%，大黄酸下降约9.21%；而大黄素含量增加约16.44%，大黄酚增加约16.12%，大黄素甲醚增加约20.01%，说明炮制工艺对中药大黄各成分影响不相同。熟大黄游离蒽醌类成分比例发生了变化，根据熟大黄多年临床使用证明，这5种游离蒽醌成分比例可能是熟大黄最佳的疗效组合，而这种成分比例的变化重新组合，可能是导致其泻下和收敛作用明显减弱，作用比较缓和；在炮制过程中，产生较多的大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等，增强其清热解毒的作用。临床上一般用于热毒引起的火毒疮疡等症。

3.3 药理相关性分析在蒸制的过程中，蒸气加热，温度高，破坏了主要泻下成分的结合型大黄酸，使其泻下作用下降；而大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量增加，可抑制血小板凝集，降低血小板活性，使凝集状态得到改善，渗透压趋于正常。因此，熟大黄相对于生大黄来说，有更好的活血祛瘀的功效。生大黄经炮制后，其药效发生了一些改变，治疗范围扩大［9，12，21-22］。同时，经过炮制，熟大黄对胃肠道刺激较生大黄有所下降。不同的中药炮制方法，产生大黄的不同炮制品，其治疗疾病也会产生差异，所以临床上要辨证施治，合理使用大黄及其炮制品。