抗病毒口服液防治甲型流感病毒感染的药效学研究*

毛 鑫，姚荣妹，包 蕾，高英杰，鲍岩岩，孙 静，郭姗姗，时宇静，崔晓兰

中国中医科学院中药研究所，北京100700

抗病毒口服液收录于《中华人民共和国药典》一部，处方中包含板蓝根、连翘、石膏和芦根等九味中药，临床常用于治疗风热感冒、温病发热、上呼吸道感染、流感等疾病［1-2］。目前抗病毒口服液的质量标准研究及临床应用研究资料较为丰富［3-4］，但药物防治病毒感染方面的基础研究主要集中在体外抗病毒作用方面［5-6］。前期研究［7］表明，抗病毒口服液对甲型H1N1流感有明显的治疗作用，可抑制炎性反应并抑制病毒增殖。本次实验在此基础上，拟通过建立甲型流感病毒体内致小鼠肺炎模型、体外急性/慢性炎症和甲型流感致细胞病变模型，对抗病毒口服液防治甲型流感病毒感染作用进行进一步的评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物病毒感染实验ICR小鼠（SPF/VAF级）190只，体质量（14±1）g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证编号：SCXK（京）2016-0011。饲养条件：中国中医科学院中药研究所ABSL-2生物安全动物房。

1.2 实验材料MDCK犬肾细胞（北纳生物，本研究室传代液氮保存）；甲型H1N1流感病毒FM1株、PR8株、2007株、2009株、天津津南株及H3N2病毒（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所及美国ATCC，由中国中医科学院中药研究所ABSL-2生物安全实验室传代，-80℃保存备用）；抗病毒口服液（杭州华润老桐君药业有限公司，批号：20170217）；双黄连口服液（哈药集团三精制药有限公司，批号：16111732）；利巴韦林颗粒（四川百利药业有限公司，批号：160622）。

1.3 试剂与仪器乙醚（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150417）；生理盐水（华润双鹤药液股份有限公司，批号：Y1609211W）；RPMI-1640培养基，胎牛血清，青-链霉素双抗，0.25%胰酶（美国，PBS缓冲液（均购自美国Gibco公司，批号：8117044，1527494，1796440，1798279，1789842）。A2型生物安全柜（美国Thermo公司）；YP1002型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；5810R型低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；Enspire型多功能酶标仪（德国PerkinElmer公司）；CKX31型倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 剂量设计抗病毒口服液：药物浓度折合生药量4.3 g/10 mL，成人用量每次10 mL，每日2～3次，小鼠每日用量4.0、2.0和1.0 g/kg，相当于临床用量2倍量、1倍量和1/2倍量。双黄连口服液：药物浓度折合生药量15.0 g/10 mL，成人用量每次20 mL，每日3次，小鼠每日用量16.5 g/kg，相当于临床用量1倍。利巴韦林颗粒：成人用量每次150 mg，每日3次，小鼠每日用量82.5 mg/kg，相当于临床用量1倍。所配药物按小鼠20 mL/kg给药，每日给药1次。

1.4.2 体内实验

1.4.2.1 对甲型H1N1流感病毒FM1株及PR8株致小鼠肺炎模型的预防作用取小鼠70只，按体质量等级随机分为正常组，模型组，利巴韦林组，双黄连组，抗病毒口服液2倍量、1倍量、1/2倍量组，每组10只。各给药组按20 mL/kg灌胃给药，每日1次，连续4天，正常组和模型组在同等情况下给予蒸馏水。第4天灌胃后1 h，除正常组外，其余各组小鼠用乙醚轻度麻醉，分别以甲型H1N1流感病毒FM1株及PR8株滴鼻感染，每只35 μL。于感染后第4天称质量后处死，解剖取肺组织，称重，计算肺指数及肺指数抑制率。

肺指数（%）=肺湿重（g）/体质量（g）×100%

肺指数抑制率（%）=（模型组肺指数-给药组肺指数）/（模型组肺指数-正常组肺指数）×100%

1.4.2.2 对甲型H1N1流感病毒FM1株及PR8株致小鼠肺炎模型的死亡保护作用取小鼠120只，按体质量等级随机分为模型组、利巴韦林组、双黄连组、抗病毒口服液2倍量、1倍量、1/2倍量组，每组20只。各组小鼠用乙醚轻度麻醉，分别以甲型H1N1流感病毒FM1株及PR8株滴鼻感染，每只35 μL。感染当天各给药组按20 mL/kg灌胃给药，每日1次，连续4天，模型组在同等情况下给予蒸馏水。观察感染后2周内动物的死亡情况，计算死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率。

死亡保护率（%）=（模型组死亡率-给药组死亡率）/模型组死亡率×100%

生命延长率（%）=（给药组存活天数-模型组存活天数）/模型组存活天数×100%

1.4.3 体外实验

1.4.3.1 对MDCK细胞的毒性试验试验前将抗病毒口服液用含2%胎牛血清的RIPM-1640培养基做1∶2-1∶256倍比稀释备用，取已长成单层的MDCK细胞，弃去原培养基，加入稀释好的药液，每个稀释度药液做4个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃，5%CO2培养箱中培养，48 h后于倒置显微镜下采用CEP法观察细胞病变情况［6］，按Reed-Muench法计算半数细胞毒性浓度（median toxic concentration，TC50）和 最 大 无 毒 浓 度（maximal atoxic concentration，TC0）。

1.4.3.2 对甲型流感病毒致MDCK细胞病变的治疗作用试验前取甲型H1N1流感病毒FM1株、PR8株、2007株、2009株、天津津南株及H3N2病毒用含2%胎牛血清的RIPM-1640培养基稀释备用；将抗病毒口服液用含2%胎牛血清的RIPM-1640培养基做最大无毒浓度下5个稀释度备用。取已长成单层的MDCK细胞，弃去原培养基，加入稀释好的病毒液，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃，5%CO2培养箱中培养2 h后，弃去病毒液，加入稀释好的药液，每个稀释度药液做4个复孔，正常组和模型组加入含2%胎牛血清的RIPM-1640培养基。将培养板置37℃，5%CO2培养箱中培养，48 h后于倒置显微镜下观察细胞病变情况，按Reed-Muench法计算半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）和治疗指数（therapeutic index，TI）。

治疗指数TI=TC50/IC50

1.5 统计学方法选择SPSS 17.0统计学软件进行数据统计分析，计量资料以表示，采用t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体内实验

2.1.1 预防作用流感病毒FM1株和PR8株感染小鼠后，小鼠肺指数较正常组均明显升高（P＜0.05）。感染前给予抗病毒口服液治疗4天，抗病毒口服液3个剂量对于流感病毒FM1株感染所致小鼠肺指数升高均有显著的抑制作用，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；抗病毒口服液1/2倍量组对流感病毒PR8株感染所致小鼠肺指数升高具有明显的降低作用，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组流感病毒FM1株、PR8株感染小鼠肺指数抑制率比较

2.1.2 对动物死亡的保护作用流感病毒FM1株感染小鼠2周内，小鼠死亡率为90%，平均存活天数为8.45天。抗病毒口服液给药4天后，小鼠死亡率均有所降低，但降低作用不明显；小鼠的平均存活天数均有延长，其中抗病毒口服液1倍量和1/2倍量组的存活天数与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。流感病毒PR8株感染小鼠2周内，小鼠死亡率为100%，平均存活天数为7.25天。抗病毒口服液给药4天后，小鼠死亡率均有所降低，其中抗病毒口服液1倍量和1/2倍量组的死亡率与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；小鼠的平均存活天数均有一定程度延长，但延长作用不明显，见表3。

表2 各组流感病毒FM1株感染小鼠的死亡保护作用比较

表3 各组流感病毒PR8株感染小鼠的死亡保护作用比较

2.2 体外实验

2.2.1 对MDCK细胞的毒性试验抗病毒口服液对MDCK细胞的TC50为356 mg/mL，最大无毒浓度TC0为250 mg/mL。

2.2.2 对MDCK细胞病变的治疗作用抗病毒口服液对甲型H1N1流感病毒FM1株、PR8株、2007株、2009株、天津津南株及甲型H3N2流感病毒致MDCK细胞病变均有明显的抑制作用，半数抑制浓度IC50为44～100 mg/mL，治疗指数TI为3.56～8.09。见表4。

表4 抗病毒口服液体对病毒致MDCK细胞病变的治疗作用

3 讨论

病毒在体内的繁殖主要分为黏附、入侵、复制及释放四个过程，而从病毒入侵机体到引起肺炎甚至机体死亡的过程主要由炎性反应及氧化损伤等多方面因素导致，因此目前抗病毒药物作用靶点主要集中在抑制病毒黏附入侵、抑制病毒复制、抑制病毒释放以及抑制机体过度免疫反应四个方面［8］。

目前中药抗病毒机制研究对以上四个靶点均有涉及：栀子可抑制病毒入侵环节，黄芩苷可抑制病毒RNA聚合酶活性，板蓝根可抑制神经氨酸酶从而抑制病毒的释放环节，而大多数中药都表现出抗炎活性［9-12］。

利巴韦林及双黄连常被用于治疗流感，故选择这两种药做为阳性对照药物以评价抗病毒口服液抗流感作用的可行性。抗病毒口服液预防给药4天可显著降低流感病毒感染所致动物肺指数升高，给药4天后对流感病毒感染所致动物死亡情况有明显的改善作用，可显著降低死亡率，增加存活天数。实验结果发现抗病毒口服液对于FM1和PR8两株甲型流感病毒感染的作用特点有所不同：抗病毒口服液的预防作用对FM1株感染所致肺炎模型较为显著；而其死亡保护作用对于FM1株感染主要体现在延长存活时间方面，对于PR8株感染主要体现在降低死亡率方面，而这种作用特点的不同可能是由于药物作用机制的多样性导致的。体外实验表明，抗病毒口服液对多种甲型H1N1流感病毒所致的细胞病变有明显的治疗作用。

综上所述，抗病毒口服液对于体内外甲型流感病毒感染模型具有明显的治疗和预防作用。