基于Box-Behnken法的天麻冻干工艺优化研究

付伟，杨群，薄雯映，沈华*（1.湖北金贵中药饮片有限公司，武汉 430051；.九州通医药集团 九信（武汉）中药研究院有限公司，武汉 430050）

天麻为兰科属植物天麻Gastrodia elataB1.的干燥块茎，是我国传统珍贵药材之一，具有息风止痉、平抑肝阳和祛风通络的作用，常用于治疗小儿惊风、癲痫抽搐、头痛眩晕、手足不遂、肢体麻木和风湿痹痛等症[1]，在《神农本草经》中被列为上品[2]，其炮制方法最早记载于《雷公炮炙论》[3]：“修事天麻十两，焙之，细剉，单捣然用”。2020年版《中国药典》[1]收载的天麻，其饮片【炮制】项下规定天麻的加工方式为采挖，清洗，蒸透，干燥，润透，切片，干燥。该方法操作复杂，过程重复，耗时费力，有效成分损失较大，制成的饮片质地坚硬，易变色，且气味特异或有酸味，嚼之有黏性，需蒸煮服用，食用不便，采用真空冷冻干燥方法处理可以有效地解决上述问题。真空冷冻干燥方法的加工过程为将采挖的鲜药材洗净后直接放入低温下冷冻，当样品完全冷冻后抽真空，低温干燥。由于整个过程都是在低温条件下进行，能够较好地保留药材的外观品质、颜色、气味，同时使有效成分保留率高，溶出速度快，开袋即食，使用方便，具有较好的发展前景[4-7]。大量试验表明，预冻时间、预冻温度、干燥温度、一次干燥时间等因素均可影响冻干样品的质量[8-11]。本试验拟用Box-Behnken 中心组合设计方法，以浸出物、天麻素、对羟基苯甲醇及巴利森苷类含量的综合评分作为指标，考察预冷冻时间、干燥温度、一次干燥时间3 个因素对天麻真空冷冻干燥工艺的影响，优选天麻冻干工艺。

1 材料

1.1 试药

天麻素（批号：110807-201809，纯度：96.7%）、对羟基苯甲醇（批号：111970-201702，纯度：99.4%）（中国食品药品检定研究院）；巴利森苷A（批号：PS011129，含量＞98.0%）、巴利森苷B（批号：PS011138，含量＞98.0%）、巴利森苷C（批号：PS011140，含量＞98.0%）、巴利森苷E（批号：PS190918-01，含量≥98.0%）（成都普斯生物科技股份有限公司）；甲醇、乙腈均为色谱级，乙醇、磷酸均为分析级，水为超纯水。

鲜天麻由金寨九州天润中药产业有限公司提供，经九信（武汉）中药研究院有限公司吴卫刚高级工程师鉴定为兰科植物天麻Gastrodia elataB1.的干燥块茎。

1.2 仪器

LGJ-10E 型冷冻干燥机[四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司]；1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；UPT-11-10T 优普系列超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；HH-6 数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 响应面法试验指标成分的测定

2.1.1 浸出物测定 天麻浸出物的测定方法参照2020年版《中国药典》通则2201 项下热浸法测定[12]，浸出物溶剂为稀乙醇。

2.1.2 含量测定 天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E指标成分的测定方法参照2020年版《中国药典》天麻项下特征图谱的方法测定[1]，天麻样品与混合对照品的HPLC 对比镜像图见图1。

图1 天麻样品与混合对照品HPLC 镜像图Fig 1 HPLC mirror image of Gastrodiae Rhizoma sample and mixed reference substance

2.2 响应面法优选天麻冷冻真空干燥工艺

根据前期试验，选择预冻时间（A）、干燥温度（B）和一次干燥时间（C）3 个因素为响应面法考察因素，以浸出物、天麻素、对羟基苯甲醇含量及巴利森苷类含量的综合评分为评价指标，根据 Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，以单因素的最佳值为中心，上下区域各给定1 个水平值，该3 个值作为响应面试验设计水平，设计3 因素3 水平17 个试验点的响应面分析，其中零点试验重复5 次，试验设计因素及水平见表1。试验结果采用 Design-Expert 11 软件进行回归分析，优化天麻的真空冷冻干燥工艺。

表1 中心组合试验设计方案中的因素及水平Tab 1 Factors and levels of the Box-Behnken design

3 结果与分析

3.1 响应面设计方案及结果

由于响应面试验使用的评价指标数量较多，为尽可能客观地反映各个因素之间的关系及各个因素水平对天麻真空冷冻干燥工艺的影响，拟采用综合加权评分法，将各个指标以一个综合指标（OD）的形式综合考察，以综合指标进行直观分析。根据各指标成分的重要性，确定浸出物（x1）与对羟基苯甲醇（x3）的权重系数均为0.1，天麻素（x2）的权重系数为0.3。巴利森苷类（x4）由于成分较多，权重系数为0.5。综合评分（OD）＝0.1x1/x1max＋0.3x2/x2max＋0.1x3/x3max＋0.5x4/x4max。Box-Benhnken 试验设计方案及结果见表2。

3.2 模型的建立与显著性检验

采用Design-Expert 11 软件对结果进行模型拟合，拟合分析结果见表3，由结果可知该模型适合采用二次方程。以浸出物、天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量的综合评分为响应值，对试验结果进行回归拟合后，各试验因子对响应值的影响可以用回归方程表示为：Y1＝0.8556 ＋0.0148A＋0.0648B＋0.0448C＋0.0443AB－0.0862AC＋0.0158BC－0.1402A2－0.0267B2－0.0427C2。方差分析结果见表4。

表2 Box-Behnken 试验设计方案及结果Tab 2 Design and data of the Box-Behnken test

表3 多种模型拟合分析Tab 3 Multiple model fitting analysis

由表4可知，回归方程使用的模型P＜0.0001，表明此模型有效可靠。失拟项是用来表示模型与试验拟合的程度，本次模型的失拟项P值为0.0706＞0.05，表明该模型无失拟因素存在，模型与实际值能较好地拟合。R2＝0.9909，说明该模型能解释99.09%响应值的变化；R2Adj＝0.9792，说明可信度较好，可以运用该模型分析。

该模型中，干燥温度（B）、干燥时间（C）、预冻时间-干燥时间（AB）、预冻时间-干燥温度（AC）、A2、C2极显著；干燥温度-干燥时间（BC）、预冻时间（A）、B2显著；说明在综合评分作为评价指标的情况下，各影响因素之间不仅存在线性关系，还存在交互影响。不同考察因素与综合评分的响应面分析见图2～4。图2及图3的响应面图坡度较陡，表明预冻时间与干燥时间、预冻时间与干燥温度交互作用较强，对综合评分的影响显著。图4的响应面图坡度平缓，表明干燥时间与干燥温度的交互作用较弱，对综合评分的影响较小。

根据 Design-Expert 11.0 软件计算结果分析可知，天麻冻干的最佳工艺为预冻时间10 h，干燥时间18 h，干燥温度47.2℃，理论计算得分为0.915，为方便试验操作，将最佳工艺调整为冷冻10 h，在温度45℃条件下干燥 18 h。

3.3 验证试验

表4 回归模型方差分析结果Tab 4 Variance analysis in regression model

图2 预冻时间和一次干燥时间及其交互作用对综合评分影响的等高线图和三维曲面图Fig 2 3D response surface plot and contour plot of pre-freezing time and primary drying time

图3 预冻时间和干燥温度及其交互作用对综合评分影响的等高线图和三维曲面图Fig 3 3D response surface plot and contour plot of pre-freezing time and drying temperature

通过Box-Behnken 试验确定天麻冻干的最佳工艺为冷冻 10 h，在温度45℃条件下干燥 18 h，在此冻干条件下，预估天麻的浸出物含量为35.0%，天麻素含量为0.44%，对羟基苯甲醇含量为 0.02%，巴利森苷类含量为 3.58%。称取天麻鲜品 3 份，每份 700 g，按照最优的工艺制备样品，测定其含量，验证冻干工艺的可行性。结果显示天麻浸出物的含量平均为34%，天麻素的含量平均为0.45%，对羟基苯甲醇的含量平均为0.03%，巴利森苷类的含量平均为3.57%，与预估值基本一致。说明该回归模型可信度高，预测效果较好，具有可重复性和可操作性，可用于天麻冻干饮片制备。

图4 干燥温度和一次干燥时间及其交互作用对综合评分影响的等高线图和三维曲面图Fig 4 3D response surface plot and contour plot of drying temperature and primary drying time

4 讨论

天麻素、对羟基苯甲醇为天麻的主要有效成分，具有抗抑郁、镇静催眠、降压等作用[13-18]。2020年版《中国药典》将天麻素与对羟基苯甲醇含量之和列为控制指标，评价天麻的质量。研究表明[19-22]，天麻中亦含有大量的巴利森苷类化合物，该类化合物可以明显改善大脑的学习记忆，具有抗抑郁、抗衰老等药理作用，是天麻的重要成分。为了更有效、客观地评价各因素对真空冷冻干燥工艺条件的影响，本文以浸出物、天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷 E 的含量作为优化天麻真空冷冻干燥工艺的评价指标。

通过前期试验确定预冻时间、干燥时间和干燥温度3 因素对天麻质量影响较大，故选择该3个因素作为Box-Behnken 响应面法试验设计的因素，确定天麻的最佳真空冷冻干燥工艺条件为：预冻时间 10 h，干燥温度45 ℃，干燥时间 18 h。冻干工艺得到的天麻产品质量稳定，可以有效防止药效成分在干燥过程中被分解，同时最大限度地保留了产品原有的色、香、味，而且在生产过程中没有添加任何防腐剂，保证了产品的食用安全性，极大地提高了产品的商业价值。

由于冻干天麻含水量低，在高湿条件下易吸潮变色，不易保存，故对包装要求比较高，前期摸索发现铝箔材质及低温条件下可以较好地防止冻干天麻吸水受潮，后期将会开展冻干天麻的储藏期试验，拟寻找冻干天麻的最适包装及最佳储存条件，为冻干天麻工业化生产提供参考。