基于JAK2/STAT3信号通路探讨通痹胶囊治疗类风湿关节炎的作用机制

闫国强，张倩，张俊艳，金颖慧，丁洪青，尹忠英，董晶晶，李宝芬，郭煊（.河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 06000；.沧县医院，河北 沧州 06000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种主要由细胞因子参与介导的慢性炎症疾病，其高发病率和致残率严重影响人们的正常生活，而发病机制的不明确导致尚未具有较满意的治疗方法[1]。

中药复方在RA 的治疗中具有多通路、多靶点的优势[2]，前期试验已证实，经通痹胶囊能改善佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠侧足红肿、关节炎指数等病理症状，其机制涉及对p38MAPK/NF-κB 信号通路的调控[3]。JAK/STAT 途径是多种细胞生长、活化、分化、凋亡及其功能发挥过程中重要的一条细胞内信号转导通路[4]，已有研究证实，在RA 发病过程中JAK/STAT 信号通路处于激活状态[5]。本实验拟通过研究通痹胶囊对AA 大鼠JAK2/STAT3 信号通路的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料

1.1 动物

Wistar 雌性大鼠48只，SPF 级，体质量（200±20）g，均购自于河北医科大学实验动物中心[SCXK（冀）2013-1-003]，在湿度50%～60%、温度（24±2）℃，环境下饲养通风环境良好，自由摄食、饮水。

1.2 试药

通痹胶囊（河北省沧州中西医结合医院院内制剂，批号：180508，规格：0.3 g/粒）；雷公藤多苷片（远大医药黄石飞云制药有限公司，批号：20170102，规格：10 mg/片）；注射用弗氏完全佐剂、乌拉坦（Sigma，USA）；白细胞介素-6（IL-6）、γ干扰素（IFN-γ）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（深圳达科为生物技术有限公 司）；p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 检 测试剂盒（Immunoway，USA）。

1.3 仪器

SZ61TRC-1LST 型解剖镜（日本Olympus 公司）；Fresco 低温冷冻离心机（美国Thermo 公司）；ZCLIPSE 50i 型光学显微镜及图像分析系统（日本Nikon 公司）；MultiSkan3 全自动酶标分析仪（美国Thermo 公司）；电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；电动组织匀浆器（美国Fluka 公司）。

2 方法

2.1 AA 模型的建立与分组[6]

将48 只Wistar 大鼠随机分为6 组，即正常组，模型组，雷公藤多苷片组，通痹胶囊低、中、高剂量组，每组8 只，适应性喂养1周。除正常组外，其余各组均给予弗氏完全佐剂制备AA 模型，将常规消毒后的大鼠右腿伸直，在足跖部中央皮内注射0.1 mL 的弗氏完全佐剂。

2.2 给药

造模后第8日开始给药，连续灌胃给药4 周，每日1 次。通痹胶囊分为低、中、高剂量组[375、750、1500 mg/（kg·d）]（分别为临床成人剂量的2、4、8 倍），雷公藤多苷片组用量为10 mg/（kg·d），给药体积为8 mL·kg－1，正常组、模型组给予相同体积生理盐水。

2.3 HE 染色观察组织病理形态学变化

给药结束后剪下炎性肿胀足，去掉足部皮置于10%中性福尔马林溶液中固定，经过脱钙、脱水、常规石蜡包埋、切片和HE 染色后，光学显微镜下观察滑膜病理组织学变化，从滑膜炎性细胞浸润、血管翳生成、滑膜增生、关节结构破坏等方面进行病理评分，评分标准参考文献方法[6]。

2.4 ELISA 法检测大鼠血清及滑膜中IL-6、IFN-γ的表达水平

大鼠眼球后静脉丛采血2 mL，3000 r·min－1离心10 min，取血清，－80 ℃冷冻备用。取血后脱颈法处死大鼠，分离滑膜组织[7]，冻于－80 ℃冰箱保存备用。检测时，充分解冻后，将组织加入适量生理盐水进行匀浆，3000 r·min－1离心10 min，取上清液。根据ELISA 法，严格按照试剂盒标准步骤检测各组大鼠血清及滑膜中IL-6、IFN-γ的含量。

2.5 Western blot 法检测大鼠滑膜组织中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 的蛋白相对表达

将大鼠关节滑膜组织用RIPA 蛋白抽提试剂进行组织蛋白提取，蛋白定量后，加入缓冲液煮沸变性，取20 μg 上样。300 mA 横流转模3 h，3%BSA 封闭30 min。加p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 一抗，室温孵育10 min，4℃过夜，室温孵育30 min。TBST 洗膜3 min×5 次。加HRP 标记的二抗（均为1∶10 000），室温封闭2 h，TBST洗膜3 min×6 次。ECL 发光试剂盒显色，曝光定影后用凝胶定量分析软件TotalLab Quant 读取条带的积分光密度（IOD）值，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参照，Image 软件分析计算其蛋白相对表达量。

2.6 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件对实验结果进行统计分析，实验数据以（±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对AA 大鼠关节组织形态学的影响

正常组大鼠关节滑膜光滑，关节间隙无异常，无软骨及骨的破坏，无滑膜组织增生、血管翳生成、炎性细胞浸润等异常病理现象；模型组大鼠滑膜组织增生严重，重度血管翳形成，大量炎性细胞浸润，软骨及骨关节破坏明显，出现严重RA 病理变化；经通痹胶囊[375、750、1500 mg/（kg·d）]、雷公虅多苷片治疗后，各治疗组病变程度较模型组明显减轻，见图1。

图1 通痹胶囊对AA 大鼠关节组织形态学的影响（HE，×100）Fig 1 Effect of Tongbi capsule on joint histomorphology of AA rats（HE，×100）

与模型组比较，通痹胶囊低、中、高剂量组和雷公藤多苷片组大鼠关节组织病理改变均有明显减轻（P＜0.05，P＜0.01）；与雷公藤多苷片组相比，通痹胶囊低、中剂量组关节组织病理改变差异无统计学意义（P＞0.05）；通痹胶囊高剂量组病理改善较为明显，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 AA 大鼠关节组织病理改变评分(n ＝8，± s)Tab 1 Score of pathological changes of joints in AA rats (n ＝8，± s)

表1 AA 大鼠关节组织病理改变评分(n ＝8，± s)Tab 1 Score of pathological changes of joints in AA rats (n ＝8，± s)

注（Note）：与模型组相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与雷公藤多苷片组相比，▲P ＜0.05（Compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01； compared with the tripterygium wilfordii polyglycoside tablets group，▲P ＜0.05）。

组别 病理改变评分模型组 2.63±0.52通痹胶囊低剂量组 1.88±0.64*通痹胶囊中剂量组 1.38±0.52**通痹胶囊高剂量组 0.88±0.64**▲雷公藤多苷片组 1.63±0.52**

3.2 对AA 大鼠血清及关节滑膜组织中IL-6、IFN-γ 含量的影响

由表2可知，模型组大鼠血清及滑膜组织中IL-6、IFN-γ的含量明显高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。通痹胶囊低剂量组可显著降低模型大鼠滑膜组织中IFN-γ的含量（P＜0.01）；通痹胶囊中剂量组可显著降低模型大鼠血清及滑膜组织中IL-6、IFN-γ的含量（P＜0.05，P＜0.01）；通痹胶囊高剂量组能够显著降低模型大鼠血清及滑膜组织中IL-6、IFN-γ的含量（P＜0.05，P＜0.01）；雷公藤多苷片组能明显降低滑膜组织中IFN-γ的含量（P＜0.01）。

表2 通痹胶囊对模型大鼠血清及滑膜组织中IL-6 和IFN-γ 含量的影响(± s，n ＝8，pg·mL－1)Tab 2 Effect of Tongbi capsule on the content of IL-6 and IFN-γ in the serum and synovial tissue of model rats (± s，n ＝8，pg·mL－1)

表2 通痹胶囊对模型大鼠血清及滑膜组织中IL-6 和IFN-γ 含量的影响(± s，n ＝8，pg·mL－1)Tab 2 Effect of Tongbi capsule on the content of IL-6 and IFN-γ in the serum and synovial tissue of model rats (± s，n ＝8，pg·mL－1)

注（Note）：与正常组相比，▲▲P ＜0.01；与模型组相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01（Compared with the normal group，▲▲P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

组别 IL-6/（pg·mL－1） IFN-γ/（pg·mL－1）血清 滑膜组织 血清 滑膜组织正常组 112.73±14.17 90.75±14.03 1583.43±180.43 1341.85±185.75模型组 138.96±9.79▲▲ 126.57±13.82▲▲ 1921.94±196.62▲▲ 1936.91±159.07▲▲通痹胶囊低剂量 142.01±19.22 135.63±15.23 1901.99±232.69 1686.77±169.62**通痹胶囊中剂量 129.46±6.23* 114.22±6.45* 1658.26±156.28* 1456.63±176.71**通痹胶囊高剂量 114.88±15.85** 103.57±20.24* 1668.24±222.11* 1477.25±220.11**雷公藤多苷片 135.95±14.61 119.45±15.50 1825.02±73.26 1406.82±224.04**

3.3 对AA 大鼠关节滑膜组织中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 蛋白相对表达的影响

如图2所示，与正常组相比，模型组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 相对表达升高（P＜0.01）；通痹胶囊低、中、高剂量组及雷公藤多苷片组均能够显著降低AA 大鼠滑膜组织 中p-JAK2/JAK2 及p-STAT3/STAT3 相对表达（P＜0.01）。

4 讨论

图2 通痹胶囊对大鼠滑膜组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达的影响Fig 2 Effect of Tongbi capsule on protein expressions of joint synovial tissue p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3

JAK/STAT 途径是多种细胞生长、活化、分化、凋亡及其功能发挥过程中重要的一条细胞内信号转导通路，已有研究证实，在RA 发病过程中JAK/STAT 信号通路处于激活状态[1]。许多细胞因子能够激活JAK/STAT 途径，其中包括IL-6及IFN-γ[8]。IL-6 及IFN-γ的水平在RA 滑膜组织中显著升高，其在RA 的发生发展过程中发挥重要作用，这些细胞因子本身并无激酶活性[9]，但当受体与相应配体结合时，可使受体二聚体化，与酪氨酸蛋白激酶JAK 相结合、聚集，并使JAK活化，活化的JAK 使受体上酪氨酸残基发生磷酸化，促使信号转导和转录激活因子STAT 蛋白与受体结合，并在JAK 的催化下发生磷酸化，磷酸化STAT 与受体亲和力降低，与受体分离，并形成二聚体的活性形式转移到核内，结合到DNA的特定反应元件上诱导相应靶基因的表达[10-13]。

JAK2 是JAK 激酶家族成员之一，广泛存在于各种组织和细胞中[14]，其在参与免疫调节和炎症过程中发挥重要的作用[15]，STAT3 是一个关键性RA 致病因子，能够抑制成纤维样滑膜细胞（FLS）凋亡、促进T 细胞存活及抗体产生[16-17]，受促炎因子调控而失衡的STAT3 信号可导致慢性滑膜炎的产生[18]，抑制JAK2 及STAT3 的磷酸化对缓解关节炎症状、促进FLS 凋亡意义重大[19-22]。在本研究中，AA 大鼠血清及滑膜组织中促炎因子IL-6、IFN-γ含量明显升高，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 相对表达升高，经通痹胶囊治疗后，IL-6 及IFN-γ的含量下降，JAK、STAT 蛋白磷酸化得到抑制。

课题组前期研究表明，通痹胶囊能够显著降低大鼠关节炎指数及足肿胀度，有效降低大鼠血清及滑膜组织中IL-1 和TNF-α的含量，并抑制滑膜组织中p38MAPK、NF-κB 及IκBα的蛋白表达[3]。p38MAPK/NF-κB 信号通路与JAK2/STAT3信号通路在RA 的发病过程中，均处于激活状态，活化的MAPKs、JAK/STAT 磷酸化它们的靶点转录因子，与相应基因的增强子结合后，启动基因转录，产生炎性因子、趋化因子，造成滑膜细胞的增生及骨组织的破坏；炎性因子、趋化因子又能活化MAPKs、JAK/STAT 路径，从而形成恶性循环，造成持久的慢性滑膜炎[5]。因此，对MAPKs 与JAK/STAT 通路的调控，将会对RA 的治疗产生积极的作用。

RA 在中医学中属“痹症”范畴，也称之为“顽痹”“久痹”“骨痹”“筋痹”“历节”“鼓槌风”“鹤膝风”等，它的病理因素主要有风、寒、湿等方面[23]，风胜为行痹、寒胜为痛痹、湿胜为着痹[24]。风寒湿邪、入侵筋脉、痹阻气血、凝滞关节而成疼痛重着之症，病及日久，损伤气血，肝肾不足而成缠绵之势。通痹胶囊能够祛风除湿、舒筋活络，用于风寒湿痹证。方中秦艽祛风湿、通经络，香附为气中之血药，行血中之气滞而止痛，共为君药；羌活、独活、制川乌祛风湿，散寒凝，止痹痛，鸡血藤、络石藤、忍冬藤取“藤以入络”能通行络脉、经筋以止痛，木瓜舒筋活络，共为臣药；桑寄生、杜仲、牛膝祛风湿兼补肝肾，当归养血活血以驱邪，马钱子加强止痛之功，共为佐药；金钱白花蛇透骨搜风，引药入络，能更好地发挥药力。中药复方具有多成分共同起效治疗疾病的特点，一般涉及多通路多靶点，对其作用机制的研究仍需更加深入。