超高效液相色谱-串联质谱方法测定谷氨酰胺胶囊中谷氨酰胺含量

匡宇明 张继荣 贺秀玲

黑龙江省传染病防治院药剂科，黑龙江哈尔滨 150500

液相色谱-质谱联用技术在药学、临床医学、生物学、化工等许多领域的应用越来越广泛，可以对体内药物及代谢产物、药物合成中间体、基因工程产品等进行定性鉴定和定量测定，解决单纯用液相色谱或质谱不能解决的许多问题。超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）理论认为提高色谱柱的效能就能增加仪器的解析度，而运用粒径低于2 μm 的小颗粒无疑是增加效能的好方法。但减小固定相的粒度以增加色谱柱效能一直是色谱仪器科学的瓶颈，因为小颗粒不仅要求系统能承受高于目前极限压力，需要更小的系统体积，并且需要能适应可能只有几秒峰宽的高速检测器[1-6]。与传统的高效液相色谱相比，UPLC 具有以下优势：高分离度，高速度，灵敏度。过去对于提高灵敏度的研究大都集中于检测器上，不论是光学检测器还是质量检测器。但是，其实运用UPLC 也能提高分析的灵敏度。目前，UPLC 多应用于代谢组学分析及其他一些生化领域，在分析化学和药物分析的分析方面运用也逐渐兴起，因为在这些领域深入研究需要更高的分析精度。使用UPLC 质谱检测器连接，对样品分析，特别是中药研究领域的发展将是一个极大的促进[7-11]。

当前对于氨基酸测定有许多种方法，其中主要有高效液相色谱法、氨基酸分析法和高效液相色谱质谱法三类。前两个方法对样品需要衍生化，分析效率低，分析时间长，样品中的其他氨基酸容易影响谷氨酰胺的分离，这使得难以准确量化，也会带来定量误差[12-16]。运用UPLC-串联质谱方法（UPLC-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测氨基酸，充分运用高效液相色谱法可分离复杂样品的能力和质谱检测法的高选择性和灵敏度特点，在生物样品中的应用具有优势[17-19]。本研究采用UPLC-MS/MS 对谷氨酰胺胶囊中谷氨酰胺含量进行测定，为此类产品质量控制和安全性评价提供方法。

1 仪器与试剂

LCMS-8050 岛津三重四级杆质谱仪[岛津企业管理（中国）有限公司/岛津（香港）有限公司]，配备电喷雾离子源；LC-30A 岛津超高效液相色谱仪（上海皖宁精密科学仪器有限公司）；色谱柱AtiantisT3 柱（1100mm×2 mm，3 μm）；SIL-30AC 自动进样；CTO-20AC 柱温箱；CBM-20A 系统控制器。谷氨酰胺对照品（中国食品药品检定研究院，含量99.7%）；乙腈（色谱纯）；甲酸（色谱纯）。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Atiantis T3 柱（1100 mm×2 mm，3 μm），柱温38℃，流动相以0.1%甲酸水溶液∶乙腈，流速0.30 mL/min，进样量：1 μL，保留时间（tR）=1.3 min，理论塔板数N=2×104，分离度R=2。采用多反应监测模式对谷氨酰胺胶囊中谷氨酰胺含量进行测定。

2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；离子检测方式：多反应监测；离子极性：负离子；电喷雾离子源，离子源接口电压：-3.0 kV；雾化气：氮气，3.0 L/min；干燥气：氮气，10 L/min；加热气：空气，10 L/min；碰撞气：氩气；接口温度：300℃。谷氨酰胺质谱分析条件参数如下：成分，谷氨酰胺；定量离子（m/z），146.10>128.26；Q1 Prerod bias（V），26；CE（V），15.0；Q3 Prerod bias（V），31.0。

2.3 对照品和供试品溶液制备

2.3.1 对照品溶液制备 谷氨酰胺对照品配制成浓度为0.1238、1.2380、4.9510、12.3800、19.7800、24.7700 μg/mL的对照品系列溶液。取样品300 μL，加500 μL 乙腈沉淀蛋白，混匀后，上清液中谷氨酰胺浓度若不在对照品系列溶液浓度范围内，加水稀释。

2.3.2 供试品溶液制备 精密称取供试品适量，加流动相适量，超声处理20 min 使溶解，用流动相定量稀释成每毫升中含0.32 mg 的溶液，精密量取该溶液与内标溶液各5 mL，置25 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液。

3 结果

3.1 专属性实验

采用超高效液相色谱串联质谱仪，色谱柱为Atiantis T3 柱（1100 mm×2 mm，3 μm），柱温38℃。流动相以0.1%甲酸水溶液∶乙腈，流速0.30 mL/min，采用多反应监测模式，按照“2.1 色谱条件”和“2.2 质谱条件”对谷氨酰胺胶囊中谷氨酰胺含量进行测定。

分别取空白溶液、对照品溶液和供试液各1 μL注入实验仪器，根据上述仪器条件进行检测，分别记录总离子流图。谷氨酰胺的保留时间为1.3 min，供试液中谷氨酰胺没有受到其他成分的干扰。见图1。

图1 谷氨酰胺UPLC-MS/MS 总离子流图

3.2 线性范围和检测限

分别取“2.3.1 项”下的谷氨酰胺对照品溶液，根据对照品浓度，取0.1238、1.2380、4.9510、12.3800、19.7800、24.7700 μg/mL 的对照品系列溶液进样，绘制标准曲线时，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，线性回归方程Y=4×10-6X+0.1336，相关系数为0.9998。谷氨酰胺在0.1232～24.7100 μg/mL 范围内呈现良好的线性关系。

检测限测定：分别取“2.3.1 项”下的谷氨酰胺对照品溶液用水稀释，记录谷氨酰胺浓度，确定检测限为9.8 ng/mL。

3.3 加样回收率试验

分别取“2.3.2 项”下的谷氨酰胺样品溶液6 份，按照“2.1 项”条件进样测定，依据谷氨酰胺峰面积，计算峰面积相对标准偏差（RSD）为2.6%，结果表明该方法重复性良好。

加样回收率试验结果如表1，当理论浓度为61.86 μg/mL，平均加样回收率为108.3%，RSD=2.2%。当理论浓度为123.68 μg/mL，平均加样回收率为102.8%，RSD=3.2%。当理论浓度为206.16 μg/mL，平均加样回收率为108.9%，RSD=4.8%。测得浓度为65.32 μg/mL，加样回收率为105.5%。谷氨酰胺常用量在0.5～1.0 mmol/L 之间，加样回收率试验结果显示，本方法能够满足谷氨酰胺测定的需要。

表1 加样回收率试验结果

3.4 样品测试

分别取“2.3.2 项”下的谷氨酰胺胶囊样品制备供试液6 份，按照“2.1 项”和“2.2 项”仪器条件进行测试，谷氨酰胺胶囊中谷氨酰胺平均含量为110.8 μg/mL。结果显示，谷氨酰胺在范围内线性关系较好，RSD 为2.2%～4.8%，谷氨酰胺定量限为9.8 ng/mL。

4 讨论

谷氨酰胺是白色结晶或晶性粉末，能溶于水，不溶于甲醇、乙醇、醚、苯、丙酮、氯仿和乙酸乙酯，无臭，稍有甜味。在中性溶液中不稳定，在醇、碱或热水中易分解成谷氨醇或丙酯化为吡咯羧醇，无臭，有微甜味。谷氨酰胺不是必需氨基酸，其在人体内可由谷氨酸、缬氨酸、异亮氨酸合成。在疾病、营养状态不佳或高强度运动等应激状态下，机体对谷氨酰胺的需求量增加，以致自身合成不能满足需要。谷氨酰胺是体内重要的氨基酸，谷氨酰胺胶囊为硬胶囊，内容物为白色或类白色颗粒状粉未，用于改善胃溃疡和十二指肠溃疡的症状[20-22]。

目前，医院使用高剂量的谷氨酰胺补剂来治疗疾病：每天20 g 的剂量用于治疗大肠炎、节段性回肠炎和腹泻，每天40 g 的剂量用于艾滋病患者、进行化疗的癌症患者和烧伤患者。目前，许多医院已经开始对使用谷氨酰胺以缩短住院时间的效果进行研究，并且相信使用其作为出生体重较轻婴儿的营养补充剂是安全的。研究表明[23]，糖尿病患者应当谨慎使用谷氨酰胺作为补剂，因为他们对谷氨酰胺的代谢过程异于常人。对癌症患者使用谷氨酰胺作为补剂也有争议。原因是谷氨酰胺有促进细胞快速分裂的作用，而细胞快速分裂正是肿瘤的特征。通过减慢身体代谢消耗并增强衰弱的免疫系统，谷氨酰胺能延长癌症患者的寿命。谷氨酰胺对孕妇是否安全尚无统一定论，羊水中的谷氨酰胺水平很高，但并不知道母乳中的谷氨酰胺水平是否也较高。谷氨酰胺已静脉输予早产儿，并未发现不良反应。供给动物谷氨酰胺，可使母牛的产奶量增加一倍。如果一位孕妇要求用谷氨酰胺治疗，那么保健人员就应对其进行评价，评估出恰当的剂量。谷氨酰胺是体内重要的氨基酸，尽管如此，服用过量氨基酸均会引起副作用的可能，谷氨酰胺也不例外，其应在保健人员的指导下服用。在保健人员的监护下，每天服用40～50 g 的人在数周的时间内尚未有不良反应[23-25]。

使用超高性能的液相色谱三重四级棒质谱法，分析谷氨酰胺胶囊中的谷氨酰胺含量，其特点为分离所需时间短，特异性强。即便谷氨酰胺不能在色谱柱中与其他氨基酸彻底分离，谷氨酰胺也不会受到检测器中其他氨基酸的影响。对不含氨基酸需要进行标准化实验处理，要简化操作过程，提高定量精度，可显著缩短实验检测时间。因此，建立了UPLC-MS/MS 测定谷氨酰胺含量，用于改善胃溃疡和十二指肠溃疡的症状，本方法操作简单。

5 小结

作为肠动力的主要来源，谷氨酰胺对肠道内膜的疾病有辅助疗效。另外，其能逆转由非类固醇抗炎药对肠道所造成的损害。谷氨酰胺具有保护大脑防止氨中毒的功能，所以人们正在研究其对神经变性疾病的功效。由于其没有明显的副作用，应对其予以足够重视。谷氨酰胺具有保护大脑的功能，作为大脑的一种能量来源，谷氨酰胺能改善心情，增强智力，并有益于长期与短期记忆。

色谱-质谱联用分析是一种高效互补的分离鉴定技术，使分离混合物、探索未知物及鉴定新化合物的在线联用成为现实。本研究采用UHPLC-MS/MS 测定了谷氨酰胺胶囊中谷氨酰胺的含量，对该方法进行了验证，为此类产品的质量控制和安全评价提供了一种检测方法。本实验建立了谷氨酰胺胶囊中谷氨酰胺的含量测定方法，结果显示，本方法具有专属性强，准确，灵敏，易于操作等优点。本方法操作较简单，方法专属性、准确性及灵敏度良好，且测试时间短，可试用于药物和生物样品中谷氨酰胺含量的测定。