川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤后氧化应激、Ca2+-ATP酶活性及炎症因子的影响*

葛 亮，曹慧玲，张 洁，徐 敏，朱小飞，陈云峰

南京中医药大学附属医院检验科，江苏南京 210029

当前，缺血性脑卒中占脑血管病的80%左右，主要因为脑血管局部动脉粥样硬化、血栓脱落及血管损伤等导致脑供血动脉栓塞，从而引起相应脑组织缺血、坏死，临床上通过溶栓、使用抗凝药物等改善脑血液循环，但由于其存在出血的风险和治疗时间窗的狭窄性，使得绝大多数患者无法得到有效救治，且血管再通导致脑组织缺血再灌注，并通过诱发氧自由基连锁反应进一步加重脑组织损伤[1]。川芎嗪是从中药伞形科植物川芎的根茎中提取的一种生物碱，有效成分为2,3,5,6-四甲基吡嗪，具有活血、化瘀、理气的功能，以及扩张血管、改善微循环、抗氧化、拮抗钙离子及抗纤维化等作用，广泛应用于脑缺血疾病的治疗[2]。本研究探讨川芎嗪通过改善脑组织氧化应激损伤、提高钙离子腺苷三磷酸酶(Ca2+-ATP酶)活性及抑制炎症因子等作用治疗脑缺血再灌注损伤，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 SD大鼠，雄性，250～300 g，由上海捷思杰实验动物有限公司提供，川芎嗪由美国Sigma公司提供。

1.2仪器与试剂 美国ABI公司提供荧光定量PCR仪；美国MD Spectramac M3公司提供多功能酶标仪。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液，批号为C428BA0042，由上海生工生物工程有限公司提供；一氧化氮(NO)、超微量Ca2+-ATP酶、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，型号分别为A012-3、A070-4、A003-1、A001-3；cDNA合成试剂盒和One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ均由日本TaKaRa提供。

1.3方法

1.3.1实验动物分组 实验动物共分为3组，每组10只。假手术组：插入线栓但不阻塞大脑中动脉；模型组：线栓法造模，给予磷酸盐缓冲液(PBS)；川芎嗪组：线栓法造模，造模24 h后，腹腔注射川芎嗪，剂量50 mg/kg，每天注射1次，连续6 d。

1.3.2线栓法建立脑缺血再灌注模型 采用线栓法致大脑中动脉栓塞(MCAO)建立脑缺血再灌注模型。动物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在CCA远心端和近心端及ECA处用动脉夹夹闭，然后近心端结扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4 mm处剪一小口，将栓线插入到ICA，这时用CCA远心端的细线轻轻系牢栓线。从血管分叉处开始算，当插入深度在18 mm时，紧紧系牢CCA远心端的细线，动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则会使栓线脱出CCA。血管外栓线不要留得过长，更不要缝在皮外，大鼠会自行拔出。缝合伤口，单笼饲养观察。缺血后2 h小心抽出栓线，形成再灌注模型，并于造模第7天处死大鼠，进行后续实验。

1.3.3神经功能评分 分别于造模第1、3、7 天对各组大鼠进行改良神经功能损伤严重程度评分(mNSS)，各项神经功能实验分值之和作为该组大鼠mNSS行为学评分，分值越高，损伤越严重[3]。

1.3.4TTC染色 用0.2 mmoL PBS配制成2%TTC溶液，避光保存，大鼠麻醉后，快速取脑，将脑组织在0 ℃的生理盐水中冰冻5 min后，由脑前极与视交叉连线中点向后沿冠状面每隔2 mm切片，切成5片，切片置于2%TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min，不时翻动脑组织切片，使其均匀接触到染液。

1.3.5大鼠脑梗死率计算 应用image proplus软件对梗死灶脑组织区域的光密度进行分析，记录光密度值并计算梗死率。

1.3.6各项指标检测 Ca2+-ATP酶活性、NO、MDA及SOD水平测定采用化学比色法测定，脑组织炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1、IL-6及IL-10] 采用PCR法测定，具体操作方法参照试剂盒说明书。炎症因子基因相对表达水平采用mRNA 2-ΔΔCT表示。

2 结 果

2.1各组神经功能评分比较 各组大鼠造模前mNSS行为学评分均为0分，神经功能正常，造模后出现神经症状，如不能完全伸展对侧前爪，行走时向对侧倾倒，损伤严重者不能行走，参照评分标准，造模第1天模型组和川芎嗪组mNSS行为学评分(分别15.0分、13.5分)与造模前比较，分数均明显增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；造模第3天川芎嗪组mNSS行为学评分(9.5分)与模型组(13.0分)比较，差异有统计学意义(P<0.05)；造模第7 天川芎嗪组mNSS行为学评分(5.5分)与模型组(10.0分)比较，分数明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2TTC染色结果 经TTC染色后，各组大鼠脑组织被染成红色，梗死区域为白色。假手术组大鼠脑组织为红色，结构对称性好；模型组鼠脑组织左侧皮质及纹状体出现白色梗死区域；川芎嗪组梗死区域有所缓解，但仍可见白色梗死灶。见图1。

注：A为假手术组；B为模型组；C为川芎嗪组。

2.3各组大鼠脑组织梗死率比较 与TTC染色结果一致，与模型组比较，川芎嗪组梗死率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠脑组织梗死率比较

2.4川芎嗪对大鼠脑组织氧化应激指标NO、MDA及SOD水平的影响 造模第7天，模型组脑组织NO和MDA水平[分别为(4.11±0.05)μmol/gprot、(5.58±0.28)nmol/mg]与假手术组[分别为(1.34±0.24)μmol/gprot、(0.89±0.04)nmol/mg]比较明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；川芎嗪组NO和MDA水平[分别为(2.55±0.11)μmol/gprot、(3.19±0.22)nmol/mg]较模型组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；川芎嗪组SOD活水平[(73.52±3.84)U/mgprot]与模型组[(46.90±4.37)U/mgprot]比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5川芎嗪对大鼠脑组织Ca2+-ATP酶活性的影响 造模第7天，模型组大鼠脑组织Ca2+-ATP酶活性[(0.63±0.01)μmolpi/(mgprot·h)]与假手术组[(1.42±0.07)μmolpi/(mgprot·h)]比较明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，Ca2+-ATP酶活性降低可减弱细胞Ca2+外排，导致细胞钙超载，川芎嗪组Ca2+-ATP酶活性较模型组升高 [(1.46±0.10) μmolpi/(mgprot·h)]，改善细胞内钙超载状况。

2.6川芎嗪对大鼠脑组织炎症因子的影响 造模第7天，模型组各项炎症因子基因相对表达水平与假手术组比较均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；川芎嗪组TNF-α、IL-1、IL-6及IL-10基因相对表达水平与模型组比较均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 造模第7天川芎嗪对大鼠脑组织炎症因子的影响

3 讨 论

缺血性脑卒中是一种由多种机制参与的复杂的病理过程，缺氧导致的氧自由基的生成，细胞Ca2+调节失衡，进而炎性反应的激活等环节最终导致神经细胞的坏死或凋亡。临床上缺血性脑卒中首选治疗方案为采用药物或介入等方法进行溶栓，尽快恢复缺血区的血液供应，减少缺血面积，挽救半暗带神经细胞，最大限度减轻对脑组织结构和功能的损伤。然而事实上溶栓治疗易继发再灌注损伤诱发氧自由基反应进而破坏血脑屏障的完整性，引起血管性脑水肿，促进炎症细胞浸润，造成更为严重的病理性损伤[4]。

近年来，川芎嗪及其衍生物作为中医治疗缺血性脑血管病的常用药物，具有抗氧化、抗凋亡等功效，有研究表明川芎嗪可通过JNK/MARK信号通路抑制缺血再灌注损伤导致的神经细胞凋亡[2]；川芎嗪还可以通过升高SOD水平及降低MDA水平保护神经细胞[5]；其衍生物川芎嗪硝酮易通过血脑屏障，减轻大鼠脑缺血后的脑梗死，保护和/或恢复神经功能，促进神经发生和少突胶质生成[6]。本文也证实，川芎嗪可有效缓解大鼠MCAO模型神经功能损伤状态，减少梗死脑组织的体积，降低梗死率。然而，目前对川芎嗪治疗机制的研究仍不全面，因此，本研究从氧自由基、Ca2+-ATP酶及炎性反应等多个方面进一步研究川芎嗪改善脑缺血再灌注损伤的作用机制，为川芎嗪的临床治疗提供实验依据。

缺血再灌注损伤导致脑组织产生大量的氧自由基，其中NO是研究的热点，缺血再灌注过程中NO水平呈现先升高后下降再升高的过程，内皮细胞型NOS(eNOS)产生的NO在缺血早期具有保护神经作用，但作用甚小，神经元型NOS(nNOS)和诱导型NOS(iNOS)产生的NO对神经组织有损伤，前者作用甚微，在病理状态下，后者大量增加，产生过量的NO，进而发挥神经毒作用，TARKOWSKI等[7]探讨了急性脑卒中患者NO及其主要代谢产物与脑损伤的关系，发现缺血早期NO具有一定保护作用，然而晚期NO具有明显的神经毒性作用，导致严重的神经功能缺损。MDA是脂质氧化的最终产物，其水平变化可间接反映组织中氧自由基的变化，SOD作为主要的清除氧自由基的酶，对抗氧自由基对细胞损伤有重要作用[8-9]。本研究中大鼠在造模后，氧化应激指标NO和MDA水平明显升高，SOD水平明显降低，说明造模引起的缺血再灌注损伤激活了脑组织的氧自由基，氧化与抗氧化平衡破坏，川芎嗪治疗后氧化指标显著下降，抗氧化指标明显提高，提示川芎嗪可有效调节损伤后脑组织的氧化平衡状态，进而降低氧自由基带来的损伤作用，保护神经细胞。

在中枢神经系统中，Ca2+参与神经细胞兴奋、神经递质释放等重要功能。钙超载被认为是各种有害因素导致神经元变性的最后共同通道，可通过激活氧化应激反应、损伤线粒体等途径引起神经细胞死亡。正常神经细胞内Ca2+与细胞外相近，主要通过电压依赖型钙通道、Ca2+-ATP酶等维持Ca2+梯度。缺血时，细胞能量代谢发生障碍，导致细胞膜Ca2+-ATP酶活性下降，细胞Ca2+内流增加，外排减少，从而引起钙超载[10]。本研究中川芎嗪可保护线粒体，提高Ca2+-ATP酶活性，促进Ca2+排出，降低钙超载状态，保护神经组织。

缺血再灌注损伤发生后，大量白细胞浸润脑组织，产生炎症因子进而加重了脑损伤，已有大量实验证明IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等细胞因子参与炎性反应[11]，但有关川芎嗪对炎症因子调节的报道较少见。本研究结果表明MCAO模型建立后大鼠脑组织中炎性反应活跃，各类炎症因子表达明显增加，继而造成神经细胞的损伤，川芎嗪各项炎症因子基因相对表达水平均显著下降，说明川芎嗪可通过抑制炎症发生改善脑组织微环境，促进神经细胞恢复，进一步探究临床川芎嗪治疗脑卒中的作用机制。