PDGF-B和PDGFR-β蛋白在狼疮性肾炎中的表达及临床意义*

张铭明，张 锐，杨小珂，帅宗文

安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科，安徽合肥 230022

系统性红斑狼疮(SLE)是一种与自身免疫介导的免疫性炎性反应为突出表现的弥漫性结缔组织疾病，其临床表现复杂，病程迁延反复，以产生许多自身抗体及大量免疫复合物沉积为特征的自身免疫性疾病[1]。狼疮性肾炎(LN)是SLE最严重的并发症之一[2]，目前对其诊断的金标准主要是通过肾脏组织活检病理检查，寻找一些简单的、特异性的标志物是其研究的热点。血小板衍生生长因子(PDGF)-B 是来源于人血小板的一种重要的促血管生成因子,它与其受体结合后，可以通过激活与细胞增殖有关的酶来调节细胞外基质的合成和分解，从而减少癌细胞表面黏附分子，促进肿瘤的生长、侵袭与转移，在肿瘤发病机制中被广泛研究[3-4]。有研究表明，PDGF-B和β型血小板衍生生长因子受体(PDGFR-β)蛋白通过多种信号通路介导细胞增殖、分化、炎性细胞浸润等病理生理过程参与肾纤维化形成[5-6]。本研究旨在进一步探讨这些蛋白在LN患者肾脏和外周血中的表达及临床意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年10月至2019年12月安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科住院 SLE患者64例为研究对象，男性7例、女性57例，年龄为19～68 岁，平均(38.8±12.0)岁。SLE患者根据文献[6]诊断标准分为LN组34例、SLE非LN组30例，LN 的纳入标准为至少符合以下3个条件中的1条:(1)24 h 尿蛋白定量(24 h UPQ)≥0.5 g，或连续两次蛋白尿≥3+；(2)存在红细胞管型、颗粒管型等各种疾病的管型尿；(3)肾损伤，肾功能异常。排除标准为各种原发性、继发性肾脏疾病。另选取本院健康体检中心体检健康者28例作为对照组，男性6例、女性22例，年龄22～67岁，且无自身免疫性疾病家族史。本研究获得本院伦理委员会的批准。

1.2仪器与试剂 免疫组织化学染色PDGF-B和PDGFR-β抗体来自于Sinobiologic公司，血清PDGF-B和PDGFR-β酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒来自于eBioscience 公司，抗 C1q 抗体ELISA检测试剂盒来自于德国Orgentec诊断公司，抗 ds-DNA抗体试剂盒由上海科新生物公司提供。洗板机为深圳雷杜公司RaytoRT3100，酶标仪为奥地利 TECAN 公司TECAN sunrise，生化分析仪为罗氏COBAS C 701全自动分析仪。

1.3标本的采集与检测 SLE肾脏组织标本来源于肾脏穿刺，免疫组化染色采用二步法，染色步骤按常规操作，肾脏组织切片进行常规脱蜡、水化，3%过氧化氢(H2O2) 室温孵育 10 min 去除内源性过氧化物酶，分别加入PDGF-B抗体(1∶100)和PDGFR-β抗体(1∶100)，阴性对照采用兔IgG作为一抗，阳性对照采用试剂公司提供的阳性对照片。结果按照试剂说明书指示以细胞核或细胞质出现颗粒状黄色物质为阳性反应。采用阳性细胞占总细胞的百分率评分和染色强度评分来综合评判。判定标准:染色强度(无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色和2分，棕褐色为3分)；阳性细胞数<10%为0分，10%～<25%为1分，25%～<75%为2 分，≥75%为3分。染色强度和阳性细胞比例得分之和为最终结果来统计阳性表达率，分数≥3 分为阳性表达；组织染色读片由两位病理医师在双盲的情况下进行，取平均值。SLE患者及对照组血清标本经3 500 r/min 离心 5 min，分离后-20 ℃保存。PDGF-B和PDGFR-β蛋白及抗 C1q 抗体、抗双链DNA(ds-DNA)抗体按照说明书进行ELISA检测。补体 C3、C4、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、24 h UPQ、估算肾小球滤过率(eGFR1)采用罗氏COBAS C 701全自动生化分析仪检测。

2 结 果

2.1各组肾脏组织中PDGF-B和PDGFR-β蛋白阳性表达率比较 LN组肾脏组织中PDGF-B和PDGFR-β蛋白阳性表达率分别为79.41%和76.47%，明显高于SLE非LN组(分别为36.67%和33.33%)和对照组(分别为6.66%和0.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)；SLE非LN组肾脏组织中PDGF-B和PDGFR-β蛋白阳性表达率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2各组外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表达水平比较 LN组、SLE非LN组外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表达水平与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。LN组PDGF-B和PDGFR-β蛋白表达水平与SLE非 LN 组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

注：A和B分别为PDGF-B和PDGFR-β蛋白在对照组肾脏组织中的表达；C和D分别为PDGF-B和PDGFR-β蛋白在SLE非LN组肾脏组织中的表达；E和F分别为PDGF-B和PDGFR-β蛋白在LN组肾脏组织中的表达。

表1 各组外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表达水平比较

2.3LN患者PDGF-B和PDGFR-β蛋白表达水平与各临床指标的相关性分析 LN患者肾脏组织中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表达水平与抗 C1q 抗体呈正相关(P<0.05)，与eGFR1呈负相关(P<0.05)，与C3、C4、hs-CRP、Cr、BUN、SLE疾病活动指数(SLEDAI)评分、抗ds-DNA抗体、24 h UPQ无相关性(P>0.05)；外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表达水平与SLEDAI评分、抗 ds-DNA抗体、24 h UPQ、抗 C1q 抗体呈正相关(P<0.05)，与补体C3、eGFR1呈负相关(P<0.05)，与C4、hs-CRP、Cr、BUN无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 LN患者PDGF-B和PDGFR-β蛋白表达水平与各临床指标的相关性分析

2.4LN患者肾脏组织和外周血PDGF-B与PDGFR-β蛋白表达水平的相关性分析 LN患者肾脏组织和外周血中PDGF-B与PDGFR-β蛋白表达水平均呈正相关(肾脏组织r=0.663,P<0.001；外周血r=0.547,P=0.001)。

3 讨 论

LN是SLE最常见的并发症之一，其临床表现复杂，进展迅速，大部分LN患者会进展为终末期肾病，而肾脏纤维化是LN肾脏病变进展至终末期肾病的共同通路[7]。近年来，大量临床和实验研究表明，肾小管间质纤维化程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标，LN肾损伤程度与有无肾小管间质炎症、肾脏纤维化密切相关，LN活动性增加可加速其纤维化进程[8]，因此，对LN患者中某些炎症因子及特异性蛋白表达的研究具有重要临床意义。

PDGF-B和PDGFR-β蛋白作为间充质细胞的有效促有丝分裂剂在细胞的迁移和增殖过程中具有重要的生物学作用。机体内间充质细胞迁移及细胞外基质的沉积与其过表达密切相关，PDGF-B和PDGFR-β蛋白不仅可以通过介导炎症因子的释放在免疫调节中发挥重要作用，而且还是间充质细胞(如成纤维细胞、血管平滑肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等)迁移和增殖的有效激活剂，参与多种疾病的发生发展。有研究表明[9]，PDGF-B可以通过PDGFR-β蛋白启动与肾纤维化相关的多条信号通路，其中与致纤维化因子转化生长因子β1(TGF-β1)的协同作用信号通路在促进肾纤维化的进展中具有重要意义。

本研究发现，PDGF-B和PDGFR-β蛋白在对照组肾脏组织中很少或无表达，在SLE非LN组中表达不高，而在LN组中高表达，在LN患者肾小球、球旁器、肾小管间质中均有表达，尤其在肾系膜细胞,间质成纤维细胞和血管平滑肌细胞表达较高。在LN组外周血PDGF-B和PDGFR-β蛋白表达水平也明显高于SLE非LN组及对照组，结果表明PDGF-B和PDGFR-β蛋白对LN的发生发展具有重要意义，其表达增多是多种通路共同作用的结果，在炎症细胞、免疫复合物损伤、治疗药物等作用下，肾间质细胞、上皮细胞、系膜细胞等PDGF-B和PDGFR-β蛋白表达上调，PDGF-B和PDGFR-β蛋白的表达上调既可通过多种通路促进细胞生长、分化及迁移，又可介导细胞炎性反应、生长、分化及增殖等生理过程，导致肾小球硬化和小管间质的纤维化。有研究表明，PDGF mRNA在健康者中表达很低，而在系膜增生性肾小球肾炎中，PDGF mRNA和受体的表达均明显升高，肾小球的损伤程度和PDGF mRNA阳性细胞数的增多具有明显相关性，增殖性肾炎PDGFR的过度表达与细胞增殖程度、损伤状态、疾病活动状态呈正相关，而PDGF-B的特异性抑制剂可明显减少肾小球内细胞的增生和炎性细胞的浸润[5,10]。本研究也发现在LN肾脏组织和外周血中PDGF-B蛋白与其受体PDGFR-β蛋白呈正相关，进一步说明PDGF-B蛋白与其受体PDGFR-β蛋白在LN 肾脏组织细胞增生及纤维化中发挥重要作用。PDGF-B蛋白与其受体之间亲和度高，PDGF信号通路的传导可能通过刺激其受体开始，再通过磷酸化、激酶活化等一系列途径介导，受体PDGFR-β蛋白的活动状态与刺激的信号强度及磷酸化的程度具有一定的相关性。

LN肾脏组织的免疫损伤主要由大量自身抗原抗体复合物沉积于肾小球和肾小管间质造成，在临床检测指标中，特异性自身抗体及补体 C3、C4、Cr、BUN、hs-CRP、24 h UPQ、eGFR1等与其病情活动性及严重程度密切相关[11]，本研究发现，在LN肾脏组织中PDGF-B蛋白与其受体PDGFR-β蛋白仅与eGFR1、抗 C1q 抗体呈正相关，而外周血中其表达水平与SLEDAI评分、抗 ds-DNA抗体、hs-CRP、24 h UPQ、eGFR1、抗 C1q 抗体均呈正相关，可能是由于LN肾脏组织免疫病理的改变与外周血中临床指标改变有不同步的发展，外周血炎症指标的发展滞后于肾脏组织病理的发展，eGFR1是肾损伤最直接的评价指标，它的变化趋势直接体现肾脏的损伤程度，抗 C1q 抗体可以通过促进细胞凋亡、抑制凋亡细胞清除，致使大量蛋白产物在肾脏沉积，肾小球补体 C1q 沉积的强度与免疫球蛋白 IgG 复合物量的多少及沉积部位相关，这可能是导致其与肾脏组织PDGF-B、PDGFR-β蛋白直接相关的原因。本研究也发现LN外周血中PDGF-B、PDGFR-β蛋白与炎症指标及特异性自身抗体密切相关，说明PDGF-B大量分泌后，PDGF-B 除了自身具有促纤维化功能外，还能够通过其他通路，诱导炎症因子释放及自身抗体的产生，从而加速细胞外基质的聚集和细胞的纤维化进程。在LN患者中诱发炎症后，DNA片段可能过度激活，通过TLR9/TGF-β1/PDGF-B 通路产生大量的PDGF-B，TGF-β1可以诱导肾纤维化，而PDGF-B可以进一步刺激系膜细胞的增生[9]。

有研究表明[12]，通过阻止PDGF-B激活途径可以有效改善肾小球肾炎等肾脏疾病和LN。在体外研究中[13],PDGF-B和PDGFR-β siRNAs基因的沉默可以减少系膜细胞增殖和迁移，采用TGF-β1/PDGF-B拮抗剂可以阻止肾纤维化和肾衰竭。对SLE 患者进行免疫抑制剂治疗后，其SLEDAI评分明显降低，伴随TGF-β1/PDGF-B蛋白表达水平下降,因此，PDGF-B/PDGFR-β 信号通路抑制剂的研究为LN患者肾纤维化的治疗提供了新的措施[12,14]。

PDGF-B和PDGFR-β蛋白参与了 SLE 肾损伤的发病机制，对LN的判断具有重要临床价值。