siRNA干扰ARD1对人结直肠腺癌细胞株基因表达谱的影响*

王晓斌，杨宏军，孙相华，代锡锋，周华华，白 松△

1.昆明医科大学第一附属医院干疗科，云南昆明 650031；2.云南省曲靖市第一人民医院肿瘤科，云南曲靖 655000

结直肠癌包括结肠癌和直肠癌，其病理类型有腺癌、鳞癌、腺鳞癌、髓样癌、印戒细胞癌、未分化癌等，但其中最常见是腺癌。2018年全球癌症数据统计报告显示，全球结直肠癌的发病率在所有肿瘤中占第3位[1]。大量研究表明结直肠癌的发生发展由基因、环境、遗传及表观遗传学改变等复杂的因素所致[2]。近年来，随着基因工程及分子生物学技术的发展，肿瘤的靶向治疗和免疫治疗在结直肠癌的治疗中发挥了重要作用，因此，寻找新的、有效检测和治疗靶点，阐明结直肠癌的发病机制，对结直肠癌的早期诊断和治疗尤为重要。ARD1基因编码的ARD1蛋白是一个乙酰转移酶，首先是在酵母细胞中发现的，在酵母细胞中，ARD1蛋白与细胞周期相关[3]；而在真核细胞中的ARD1蛋白也具有乙酰转移酶的活性，能乙酰化多种蛋白质[4]。我国多位学者研究发现，人ARD1(hARD1)蛋白在胃癌、结肠癌、乳腺癌、鼻咽癌等恶性肿瘤组织中呈高表达[5-8]，但相对于其他很多已知功能的基因和蛋白，ARD1的生物学功能仍不清楚。据此，本研究通过siRNA特异性抑制人结直肠腺癌细胞株ARD1的表达，再利用基因芯片技术分析ARD1沉默前后基因表达谱的变化，旨在通过对其他已知生物学功能的基因变化来阐明ARD1的功能及其在结直肠癌发生发展中的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1材料来源 结直肠腺癌细胞株HCT-8和SW620(中科院上海肿瘤研究所)；培养基Opti-MEM®、LipofectamineTM2000、Trizol(美国Invitrogen公司)； RPMI-1640培养基、L-15粉剂、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)；焦碳酸二乙酯(DEPC)、二甲基亚砜(DMSO)由美国Sigma公司提供；新生牛血清(中国杭州四季青公司)；PBS干粉(北京中杉金桥公司)；siRNA由RiboBio公司(上海)合成。本研究使用由上海伯豪生物技术有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心提供的安捷伦人全基因4×44K芯片并由该公司提供技术平台及数据分析系统。

1.2人结直肠腺癌细胞株HCT-8和SW620培养 HCT-8生长于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基中，SW620细胞生长于含10%新生牛血清的L-15培养基，37 ℃、5%CO2恒温条件下常规培养及传代。

1.3siRNA的设计合成 本课题组前期的研究中[9]，筛选出沉默效率最高的siRNA，该序列成功将HCT-8和SW620的ARD1基因沉默，并通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实该siRNA沉默效率达79.7%(以Actin为内参)，其靶序列为GGT GGA GAG CAA AGG CAA T，正义链：5′-GGU GGA GAG CAA AGG CAA U dTdT-3′，反义链：3′-dTdT CCA CCU CUC GUU UCC GUU A-5′。将该序列交由Ribobio公司合成，阴性对照-siRNA也购自该公司，锐博公司对该序列保密。

1.4siRNA转染HCT-8、SW620细胞 HCT-8和SW620两株细胞分别设转染组、阴性对照组和空白对照组。其中转染组使用ARD1-siRNA按LipofectamineTM2000转染步骤进行细胞转染；阴性对照组使用阴性对照-siRNA转染，转染步骤同转染组。空白对照组培养板中不做任何处理。

1.5转染效率检测 转染20 h后，用倒置荧光显微镜对各组细胞进行拍照、对比及记录，观察结束后将培养板放入37 ℃、5%CO2条件下继续培养。

1.6RNA提取和质检 培养72 h后，Trizol试剂提取6个样品的总RNA，用Nanodrop ND-1000超微量分光光度计检测RNA浓度和纯度，采用安捷伦2100生物分析仪按标准流程评估6个RNA样品的质量，合格样品的标准是2 100RIN≥7.0并且28S/18S≥0.7。

1.7基因芯片检测质控 各组基因芯片质控指标为变异系数(CV)和检出率，CV计算方法为标准偏差与平均值之比，用百分数表示，安捷伦表达谱芯片通过10次重复探针点信号的CV来判断芯片的稳定性和技术的稳定性；检出率的计算方法为检出点总数与全部探针数的比值。

1.8芯片的杂交和分析 使用安捷伦微阵列芯片扫描仪对本研究完成杂交的芯片进行扫描，然后用安捷伦特征提取软件10.7读取数据，用安捷伦基因表达数据分析软件11.0对数据归一化处理，算法为四分位点函数。差异基因筛选标准为上调或下调的倍数变化(FC)≥2.0或FC≤0.5。为使差异基因更具代表性，本研究分别在两株细胞的阴性对照组与空白对照组之间比较、转染组与阴性对照组之间比较，比较出两组细胞的差异基因后用Microsoft office Access 2003软件求其交集得出共同发生了变化的基因，再在共同变化的基因中挑选出共同上调或下调2倍以上的基因，除去GenBank中没有注释的基因后作为研究的基因。将筛选出的表达差异的基因上传至SBC生物芯片分析系统(网址：http://sas.ebioservice.com/)，采用美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本信息注释(NCBI Entrez Gene 数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)、基因本体论(GO)功能注释(GO数据库http://www.geneontology.org/)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析(KEGG数据库 http://www.genome.jp/kegg/)等方法对差异基因按生物学过程进行归类，查阅核苷酸序列数据库(GenBank)及相关文献，对其结果进行深入的分析和讨论。

1.9统计学处理 使用SBC生物芯片分析系统(网址：http://sas.ebioservice.com/)，数据采用t检验进行统计学分析，取P<0.05和q<0.05为筛选显著性pathway和GO的阈值。

2 结 果

2.1荧光显微镜观察siRNA转染效率 转染20 h后倒置荧光显微镜观察，荧光细胞代表成功转染的细胞，两株细胞的转染效率均达到80%以上。

2.2各组RNA 样品的提取和质检结果 HCT-8-转染组、HCT-8-阴性对照组和HCT-8-空白对照组总RNA样本的A260/A280的值分别为1.87、1.88、1.90；SW620转染组、SW620-阴性对照组和SW620-空白对照组总RNA样本的A260/A280的值分别为1.85、1.88、1.89。电泳结果证实6个样品均为2 100RIN>7.0并且28S/18S>0.7，说明已抽提到纯度较高、完整性较好的总RNA，见图1、2。

图1 HCT-8细胞总RNA样品凝胶电泳图

图2 SW620细胞总RNA样品凝胶电泳图

2.3基因芯片检测质控 对各组芯片进行检测质控，显示质控指标CV全部小于10%，表示芯片具有良好的稳定性和技术性，见表1。

表1 各组芯片质控指标CV和检出率(%)

2.4差异基因的筛选 安捷伦人全基因表达谱芯片涵盖了17 704个转录本(RNA)，通过该芯片分析，HCT-8和SW620两株细胞阴性对照组与空白对照组比较，共同上调2倍以上的基因数有13个，包括IFI44L、XDH、CCL4等，共同下调2倍以上的基因数有8个，包括RCOR1、ANKLE1、DUOX1等；转染组与阴性对照组比较，HCT-8和SW620两株细胞共同上调2倍以上的基因数有21个，共同下调2倍以上的基因数有15个，见表2、3。

表2 HCT-8和SW620两株细胞转染组和阴性对照组比较共同上调2倍以上的基因

表3 HCT-8和SW620两株细胞转染组和阴性对照组比较共同下调2倍以上的基因

2.5差异基因的生物学信息分析

2.5.1差异基因功能GO分析 通过GO分析，阴性对照组与空白对照组比较，与分子功能相关的差异表达基因占0.07%(11/15 374)，其中包括催化活性、运输活性、结合、电子载体活性等；与生物过程相关的差异表达基因占0.09%(13/14 369)，其中包括繁殖、免疫系统过程、代谢过程、细胞过程等功能;与细胞组成相关的差异表达基因占0.08%(13/16 123)，包括胞外器官、大分子复合物、突触等。GO分析结果显示，差异表达的基因主要与电子载体活性、病毒繁殖、对刺激的反应等相关性较高。转染组与阴性对照组比较，与分子功能相关的差异表达基因占0.17%(26/15 374)，其中包括结构分子活动、转运活动、通道调节活动、核酸结合、蛋白结合、转录调节活性、翻译调节活性、分子传感器活动及转录因子活性等；与细胞组成相关的差异表达基因占0.17%(27/16 123)，包括细胞质、细胞外基质、细胞膜等。与生物过程相关的差异表达基因占0.2%(29/14 369)，其中包括:代谢过程免疫系统程序、繁殖程序、发育过程等；GO分析结果显示，差异表达的基因与胞外器官、节律程序、生殖程序、免疫系统程序、生物黏附、辅助性运输蛋白活性、翻译调控活动、生物过程的正向调节等功能相关性较高。

2.5.2差异基因与信号通路的相关性分析 差异基因信号通路分析结果显示，阴性对照组与空白对照组比较表达差异的基因与自由基诱导细胞凋亡通路、细胞因子与炎性反应、IL-17信号通路、细胞因子与细胞因子相互作用、 胰岛素信号通路、过氧化物酶体增生物激活受体信号通路等多种重要信号通路相关。转染组与阴性对照组比较表达差异的基因与Tolls样受体信号通路、自由基诱导细胞凋亡通路、ERBB2在信号转导和肿瘤中的作用、细胞因子受体在T细胞极化进程中的选择性表达、大肠癌、胰腺癌、肾细胞癌、转化生长因子-β信号通路、细胞周期、细胞因子信号通路、促分裂原活化蛋白激酶信号通路、癌症通路等多种重要信号通路相关。差异表达的基因中主要是XDH、转化生长因子-β2等基因参与了上述通路的信号转导。

3 讨 论

ARD1在健康人体组织中都有表达[10]，但在肿瘤组织，特别是恶性肿瘤组织中呈高表达，本课题组前期的研究中从mRNA和蛋白水平证明了ARD1在人结直肠腺癌细胞株HCT-8、LS174T和SW620中均为高表达[11]；从蛋白水平证明了ARD1在人体组织中的表达水平结直肠癌组织高于癌旁和切缘组织，正常结直肠组织几乎不表达[6]；在结直肠癌裸鼠动物模型的肿瘤组织中也得出了类似的结果[12]。研究发现ARD1的5种亚型，分别是mARD1198、mARD1225、mARD1235、hARD1131和hARD1235，ARD1在人类正常细胞中，ARD1对细胞增殖起促进作用，但在人类的肿瘤细胞中，起促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用[13-14]。这些研究表明ARD1有可能成为结直肠癌早期诊断的特异性肿瘤标志物或者基因治疗中的特异性靶点。RNA干扰作为未知基因功能的研究手段之一，广泛应用于肿瘤的研究和治疗[15-19]；我国学者也预测RNA干扰药物可能在未来成为治疗肿瘤、艾滋病、阿尔茨海默病等重大疾病的主流药物[20]。

本研究发现ARD1经RNA干扰后的转染组和阴性对照组与空白对照组比较，随着时间的延长，细胞的生长速度显著减慢，凋亡细胞显著增多。这不仅证实了ARD1对保持细胞的正常活性有着重要的意义和ARD1在细胞生存中的关键作用，同时也反向说明了本研究中siRNA-ARD1对ARD1的沉默效果。此外，利用基因芯片技术杂交分析后转染组与阴性对照组比较，HCT-8和SW620两株细胞均出现了ARD1的同源基因ARD1A和ARD1B下调，再次验证了本研究中siRNA-ARD1对ARD1的沉默效果。对于siRNA沉默ARD1后出现的这种细胞增殖速度减慢、凋亡增加的现象，推测可能与以下几种机制有关：(1)与ARD1的关系。前面提到ARD1蛋白作为乙酰转移酶，在肿瘤细胞中起促进ARD1作为NATs中增殖和抑制凋亡的作用，当ARD1被siRNA沉默后，靶蛋白被其他乙酰转移酶乙酰化，错误的乙酰化蛋白无法被细胞识别而是细胞进入凋亡程序。ARD1与β-catenin有关。研究证实了在肺癌中ARD1激活了β-catenin，进而激活了cyclin D1促进肺癌发展的途径[21]，ARD1对β-catenin乙酰化后激活上述通路，加速癌细胞发展的细胞周期循环。有研究发现ARD1-β-catenin-cyclin D1 途径中可能有外源性因子直接影响β-catenin或cyclin D1，可能是NATH-hARD1底物乙酰化激活了一个组氨酸转移酶，后者HAT再乙酰化β-catenin导致它的活化。(2)与转染试剂脂质体的关系。大量研究证实了脂质体作为转染试剂，本身会参与及影响细胞的增殖及凋亡，如抑制ATP酶的活性、参与蛋白激酶C通路调节等[22]。而这些作用就是脂质体所致的细胞毒性，对细胞的生理活动产生很大的影响。本研究中，对转染后的细胞进行动态观察时发现有时阴性对照组部分细胞出现成片死亡，其原因可能就是该部位由于脂质体的浓集导致的细胞成片死亡。因为阴性对照组中加入阴性对照-siRNA不会对细胞基因表达产生影响，通过对比阴性对照组和空白对照组在基因表达谱上的差异，实际上就是验证脂质体对细胞基因表达产生的影响，将对比发现的差异基因通过信号通路分析，差异基因主要参与了自由基诱导细胞凋亡通路、IL-17信号通路等有关，其中在自由基诱导细胞凋亡中可能通过上调XDH基因、介导超氧阴离子发挥诱导细胞凋亡的作用，从而诱导细胞发生凋亡。通过本研究也从基因mRNA层面证明了脂质体对细胞生理活动会产生影响。所以，RNA干扰的研究中应充分关注脂质体的细胞毒性作用，同时需要研发新的转染速度快、转染效率和基因沉默率高、细胞毒性低的转染试剂。本研究利用转染组与阴性对照组比较其基因表达谱的差异，是因为转染组和阴性对照组的细胞受到脂质体的影响，转染组的siRNA-ARD1进入细胞后可以高选择性、高效率地沉默ARD1，而阴性对照组中加入的阴性对照-siRNA进入细胞后并不会引起基因表达谱的变化，这样的设计最大程度消减了脂质体对研究结果的影响，使实验结果更加客观。此外，本研究将两株细胞分析所得差异基因的数据用Microsoft office Access 2003软件求其交集得出了共同发生变化的基因，再在共同变化的基因中挑选出共同上调和下调2倍以上的基因，除去GenBank中没有注释的基因后作为进一步研究的基因。虽然这样筛选出的差异基因少了，但这些基因均在两株细胞中出现了共同的变化，与ARD1和结直肠癌的关系更密切，不仅可以减少数据分析的工作量，还更有助于发现与ARD1紧密相关的基因。按上述方法筛选出基因，经GO分析和信号通路分析后，发现ARD1与结直肠癌通路、转化生长因子-β信号通路、促分裂原活化蛋白激酶信号通路等相关性最大，差异表达的基因中主要是转化生长因子-β2基因参与了上述通路的信号转导。转化生长因子-β2是转化生长因子-β家族中的一个亚型，通过检索Oncomine数据库中转化生长因子-β2在实体肿瘤中表达水平，在456个研究数据中有44个研究表达升高，有34项研究表达降低。赵丽等[23]研究发现转化生长因子-β2在肺腺癌组织中表达明显下调，且转化生长因子-β2低表达的肺癌患者总生存期更短。在结直肠癌发生发展中，转化生长因子-β也是作为肿瘤抑制因子发挥作用的[24]。但在细胞分化的各个时期，其机制并不相同，在G1早期，转化生长因子-β通过诱导抑制信号作用于原癌基因c-myc，从而阻止肿瘤形成；而在G1晚期，转化生长因子-β通过增加CDK的抑制性蛋白抑制CDK的功能，使G1期细胞停止生长，进而诱导细胞分化或凋亡。本研究中，结直肠癌细胞系中ARD1沉默后转化生长因子-β2表达明显上调，结合前期研究，推测ARD1是在结直肠癌的发生发展中发挥原癌基因的作用，通过结直肠癌通路、转化生长因子-β信号通路、促分裂原活化蛋白激酶信号通路等参与了结直肠癌的发生发展。

本研究利用基因表达谱芯片分析了siRNA干扰ARD1的表达后对人结直肠腺癌细胞株基因表达谱的影响，首先，本研究从基因层面证明了脂质体对细胞的毒性作用，在以脂质体为载体的科学实验中，其对细胞的毒性作用需要研究者引起足够的重视；另外，本研究初步探讨了ARD1的功能和它在人结直肠腺癌细胞中的生物学效应，推测ARD1是在结直肠癌的发生发展中发挥原癌基因的作用，通过结直肠癌通路、转化生长因子-β信号通路、促分裂原活化蛋白激酶信号通路等参与了结直肠癌的发生发展。本研究也为继续深入研究ARD1提供了新的线索，为研究者了解结直肠癌的发病机制、药物研发、疫苗研制和基因治疗等更深入的研究提供了理论依据。