金针菇无细胞滤液合成纳米银颗粒

朱雨婕，代安然，李佳铭，吴凡，杨崇婧，陈磊

(江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术重点实验室，江苏 无锡，214122)

近年来，以生物积累、生物转化或生物分子为基础的金属纳米粒子(如Ag、Au、Pd等)生物合成方法，因具有生态友好、安全高效等优点，正受到越来越多的关注[1]。其中，由蘑菇分泌物合成的纳米颗粒具有分散性好、稳定性高、保存期长等优点，因而在绿色制造、功能食品和医药材料等领域已经展现出巨大的潜力[2-3]。到目前为止，相关学者已在Pleurotussp.，Ganodermasp.，Lentinussp.等多种蘑菇中通过细胞内和/或细胞外催化合成的方式，实现了金属/非金属纳米颗粒的生物合成[4]。研究表明，利用食用菌的无细胞滤液(cell-free filtrate，CFF)进行胞外合成，具有价格低廉、环境友好、反应条件温和可控以及易于分离等优点[5-6]，因而更具应用潜力。例如，董丽娜等[7]利用秀珍菇菌丝体的CFF不仅实现了AgNPs的可控合成，并且证实产物具有优良的抑菌活性和广谱抗菌活性。利用蘑菇合成的银纳米颗粒(silver nanoparticles,AgNPs)在抗菌剂、废水处理和催化剂等领域有着广泛的应用，相关产品的需求量越来越大[4,8]。

金针菇(Flammulinavelutipes)富含蛋白质、多糖、类黄酮和多酚等生物分子，不仅具有较高的营养价值[9]，在金属/非金属元素的生物转化方面也表现出极好的潜力，如利用金针菇合成生物三聚体-金纳米颗粒(AuNPs)，并作为一种多相催化剂用于减少有机污染物[10]；利用金针菇自身的解毒机制实现SeNPs的胞内合成[11]。然而，利用金针菇进行纳米颗粒的胞外合成则鲜有报道，以金针菇发酵产物进行纳米银颗粒的合成也有待研究。

本研究利用金针菇的无细胞滤液(cell-free filtrate ofFlammulinavelutipes,FV-CFF)进行AgNPs的生物合成，进而通过反应动力学生成曲线探讨冻融和pH等因素对FV-CFF合成AgNPs的影响。最后，结合产物粒径和紫外可见(UV-Vis)吸收光谱的分析结果，讨论FV-CFF的成分及冻融和pH等不同处理条件对其还原力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金针菇(Flammulinavelutipes)CICC 50051，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)；AgNO3、CH3COOH、NaOH、3,5-二硝基水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸、FeCl3等，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；BCA法蛋白浓度测定试剂盒(增强版)，碧云天生物技术有限公司；纳米银(AgNPs)标准溶液，张家港耐尔纳米科技有限公司。

1.2 仪器与设备

H2-2型电热恒温振荡水浴箱，上海精宏实验设备有限公司；Enspire 2300型酶标仪，美国PerkinElmer 公司；FAl004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；全温摇床柜HYG-A，太仓市实验设备厂；纳米激光粒度及zeta电位分析仪ZEN3700，马尔文仪器有限公司；透射电子显微镜(TEM，H-7650)，日本日立株式会社。

1.3 实验方法

1.3.1 金针菇菌丝体生长曲线的测定

金针菇种子液配方(g/L)：葡萄糖20，酵母20，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，VB10.5，装液量为200 mL/500 mL摇瓶。高压灭菌后，接入10片1 cm×1 cm金针菇PDA平板切片，于25 ℃，160 r/min摇床培养7 d后，按体积分数5%接种于发酵液中(配方与种子液一致)，于160 r/min摇床中25 ℃培养。每天收集发酵产物，洗涤并烘干菌体至恒重，测定生长曲线，并用DNS法测定发酵液中的残糖含量(n=3)。

1.3.2 无细胞滤液FV-CFF制备

将金针菇菌丝体发酵7 d后无菌过滤，收集菌丝体，并用无菌水洗涤3～5次，转移到无菌去离子水(200 mL)中继续培养3 d。抽滤，去除菌丝体，即得无细胞滤液FV-CFF，保存于4 ℃冰箱中，待用。

1.3.3 FV-CFF合成纳米颗粒

配制浓度为6 mmol/L的AgNO3溶液，并按照FV-CFF∶AgNO3溶液以2.0∶0.6体积比混合，并以超纯水补足至4.0 mL，混合均匀，于100 ℃加热反应30 min。反应结束后，扫描415 nm处的吸光度值，以所购买的纳米银标准溶液做标准曲线，测定AgNPs的产率。

1.3.4 AgNPs的合成及影响因素

1.3.4.1 FV-CFF及AgNO3添加比例对AgNPs合成的影响

将FV-CFF与AgNO3溶液(6 mmol/L)以1∶3～12∶3的体积比混合(对应发酵液比例5%～60%)，并以超纯水补足至4.0 mL，100 ℃水浴加热30 min，反应结束后迅速冰浴冷却至室温，测定OD415，并计算AgNPs产量。固定FV-CFF添加量为2.0 mL，测定AgNO3添加浓度对AgNPs生成的影响。

1.3.4.2 pH对FV-CFF合成 AgNPs的影响

经测定，初始FV-CFF的pH为7.22，分别用微量醋酸溶液和NaOH 溶液(均为100 g/L)将FV-CFF调节 pH 到 3、5、7、9、11，按1.3.3小节中所述条件进行反应，测定不同pH下FV-CFF合成纳米银的效果。

1.3.4.3 冻融对FV-CFF合成AgNPs的影响

根据确定的FV-CFF添加量及AgNO3浓度，测定50～100 ℃下FV-CFF冻融前后(冻融后离心除去不溶物)合成AgNPs的动力学生成曲线。

1.3.4.4 冻融前后的FV-CFF在pH 11时合成AgNPs效果

选择AgNO3终浓度为0.6 mmol/L(即0.4 mL)，FV-CFF(pH 11)添加比例为15%(即0.6 mL)，并以超纯水补足4.0 mL，测定FV-CFF冻融前后(pH 11)合成AgNPs的动力学生成曲线。

1.3.5 检测与分析方法

1.3.5.1 冻融前后FV-CFF中的主要成分及还原力测定

冻融前后FV-CFF中总蛋白、总糖和还原糖含量的测定分别采用BCA法[12]、苯酚-硫酸法[13]和DNS法，可溶性固形物含量的测定采用农业行业标准NY/T 2 637—2014[14]中的折射仪法。

冻融及pH对FV-CFF总还原力的影响采用铁氰化钾法评价[15]。取0.2 mL不同样品，分别加入1 mL pH 6.6的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L)和1 mL铁氰化钾溶液(1 g/mL)混合均匀，50 ℃加热反应20 min，再加10%三氯乙酸0.2 mL终止反应，以4 000 r/min离心10 min。吸取0.2 mL上清液加去离子水稀释1倍，加0.04 mL 1% FeCl3溶液，常温静置反应10 min，测定700 nm波长处的吸光度。吸光度值的大小代表铁离子还原力的大小，以20 mg/L的Vc溶液作为阳性对照。

1.3.5.2 AgNPs的表征

分别取冻融前后及不同pH下的样品与AgNO3在100 ℃反应30 min，吸取生成的产物溶液，分别扫描300～700 nm范围内的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱；将样品在铜网碳膜上制样，干燥后使用透射电子显微镜在80 kV的加速电压下获得产物的形貌特征；使用马尔文纳米激光粒度仪测定样品及产物的粒度分布。

1.3.6 数据处理

所有试验均采用三平行设计(n=3)，试验数据采用Sigma plot 14.0软件进行统计分析和作图。

2 结果与讨论

2.1 金针菇菌丝体的生长曲线

如图1所示，金针菇菌丝接种后，生物量从第1～6天呈线性上升趋势，这是由于金针菇菌丝体在种子培养基中预培养7 d，因此转接后几乎没有滞后期；第6～8天进入快速的对数增长阶段，第8天以后进入平稳阶段。而金针菇发酵液中的残糖含量一直在下降，并在第7天降至最低。由图1可知，金针菇菌丝在转接后第7天时生长最为旺盛，之后随着碳源消耗殆尽，菌丝的生长进入稳定期，因此选择发酵至第7天的菌体进行之后的实验。

图1 金针菇菌体生长曲线及发酵液中残糖的变化Fig.1 Growth curve of F.velutipes mycelia and the change of residual sugar in fermentation broth

2.2 纳米银颗粒的合成

2.2.1 最大吸收波长及标准曲线

将FV-CFF与AgNO3溶液加热反应后出现明显的棕褐色(纳米银特征颜色)，且溶液澄清。初步分析，FV-CFF具有一定的还原力，可以将Ag+还原为0价纳米银。此外，溶液中还具有可以起稳定作用的大分子成分，因此生成的溶液并无单质银沉淀产生。配制不同浓度的AgNPs标准溶液，扫描最大吸收波长为415 nm，测定415 nm处纳米银标准曲线为y=6.884 9x+0.043 6，R2=0.999 4。

2.2.2 FV-CFF及AgNO3添加比例的确定

如图2-a所示，在FV-CFF添加比例为5%～50%，合成的AgNPs浓度呈线性增加的趋势，在FV-CFF添加总比例50%时，AgNPs浓度为0.31 mmol/L；此后AgNPs增加趋势减缓。因此接下来的实验中，选用FV-CFF添加总比例为50%。固定FV-CFF添加比例为50%，探讨不同AgNO3添加浓度对AgNPs生成的影响，结果如图2-b所示，随反应体系中AgNO3浓度升高，AgNPs浓度逐步上升，当反应体系中AgNO3浓度达到0.9 mmol/L时，AgNPs产量达到0.30 mmol/L，之后AgNPs产量趋于稳定，增长不显著。因此，在后续实验中，选用AgNO3终浓度0.9 mmol/L。

图2 FV-CFF添加比例对AgNPs合成的影响(a)，AgNO3浓度对合成AgNPs的影响(b)Fig.2 Effect of FV-CFF addition ratio on AgNPs synthesis (a),the effect of AgNO3 concentration on AgNPs synthesis (b)

2.2.3 pH对FV-CFF合成纳米银的影响

如图3-a所示，pH对FV-CFF合成AgNPs的效果影响显著，在pH低于5时，合成能力较弱，且随pH的增高，AgNPs增加幅度较小，而在pH 5～11，AgNPs的合成基本呈线性增加趋势，在pH 11时达到最高，为0.58 mmol/L。在pH 11.0条件下，于100 ℃加热，5～10 min内AgNPs产量迅速升高，10 min后AgNPs产量增长减缓，20 min时AgNPs产量便已达到最大值，之后趋于稳定(图3-b)，但合成的纳米银溶液有较多黑色沉淀产生。

图3 pH对FV-CFF合成AgNPs的影响(a)及FV-CFF在pH 11、100 ℃时合成AgNPs的动态曲线(b)Fig.3 Effect of pH on mycosynthesis of AgNPs by FV-CFF (a),dynamic changes of AgNPs formation in FV-CFF at pH 11,100 ℃ (b)

进一步优化发现，在pH 11时反应体系的最佳添加量为：AgNO3浓度0.6 mmol/L，FV-CFF(pH 11)添加比例15%。

2.2.4 冻融前后FV-CFF合成纳米银的动力学生成曲线

根据2.2.2小节中确定的FV-CFF添加量及AgNO3浓度，测定初始pH下(即pH 7.22)AgNPs的动力学生成曲线，实验结果如图4-a所示。为了考察FV-CFF中成分对AgNO3还原效果的影响，将发酵液进行冷冻，融化后发现有絮状物漂浮于液面，离心除去絮状不溶物，取上清液依照上述实验条件测定AgNPs的动力学生成曲线，实验结果如图4-b所示。

a-冻融前；b-冻融后图4 冻融前后FV-CFF生成AgNPs的动力学曲线Fig.4 Kinetic curves of AgNPs produced by initial and thawed FV-CFF

由图4可知，等温热处理过程中，冻融前后样品中AgNPs含量均随热处理时间的延长而升高，其升高速率随热处理温度的升高而加快。2组样品中AgNPs的生成反应，表观上均遵循零级反应动力学模型Ct=C0+k·t，根据动力学曲线拟合方程得出各曲线的参数如表1所示。

表1 冻融前后FV-CFF(pH 7.22)生成AgNPs的动力学回归参数Table 1 Kinetic regression parameters of AgNPs produced by initial and thawed FV-CFF (pH 7.22)

2.2.5 冻融前后FV-CFF在pH 11时合成纳米银的动力学反应

为考察pH 11时FV-CFF对AgNPs生成的影响，根据2.2.3小节实验中确定的FV-CFF添加量及AgNO3浓度(即AgNO3浓度0.6 mmol/L，FV-CFF添加比例15%)，取冻融前后的FV-CFF调pH11后与AgNO3进行反应，测定AgNPs的动力学生成曲线。如图5所示，初始FV-CFF(pH 11)在50～90 ℃范围内合成AgNPs的反应均遵循零级动力学模型，即Ct=C0+k·t，而100 ℃时产物呈对数增长趋势。冻融除去絮状不溶物后，AgNPs的生成反应动力学则均遵循零级动力学模型。因此2组样品的动力学曲线仅按照50～90 ℃的数据拟合方程，得出各曲线的参数如表2所示。

a-冻融前；b-冻融后图5 冻融前后FV-CFF在pH 11生成AgNPs的动力学曲线Fig.5 Kinetic curves of AgNPs produced by initial and thawed FV-CFF at pH 11

表2 冻融前后FV-CFF在pH 11时生成AgNPs的动力学回归参数Table 2 Kinetic regression parameters of AgNPs generated by initial and thawed FV-CFF (pH 11.0)

根据阿累尼乌斯方程k=kf·exp(-Ea/RT)，将上述4种不同反应体系以1/Tvs lnk作图，结果如图6和表3所示，其中，C0是AgNPs的初始含量，Ct是AgNPs的含量，单位为mmol/L；T是热力学温度，单位为K；R是摩尔气体常量，8.314472 J/(mol·K)；k为速率常数，单位为h-1；kf是频率因子；Ea为活化能。以样品I为例(表3)，AgNPs生成反应的速率常数与热处理温度的对数关系式为lnk=-11 902(1/T)+31.362，其对应的指数关系式为k=e31.362·exp(-11 902/T)=4.17×1013·exp(-98.96/RT)，符合阿累尼乌斯方程k=kf·exp(-Ea/RT)，其表观频率常数kf= 4.17×1013h-1，表观活化能Ea=98.96 kJ/mol。

图6 不同处理条件下FV-CFF生成AgNPs的阿累尼乌斯方程曲线图Fig.6 The Arrhenius equation curve of AgNPs formation using different processed FV-CFF

结果表明，4个反应体系都是零级反应(表3)，此时，反应物浓度不是影响化学反应的决定因素。因此，虽然在pH提高到11时，降低了反应物的浓度，但不会影响AgNPs的生成速度。由此可知，造成4个样品中表观速率常数和表观活化能不同的因素，应当与冻融前后除去的成分以及pH的变化有关。

样品I比样品II活化能低，说明冻融前初始FV-CFF更容易生成AgNPs。初步推断，冻融后除去的絮状不溶物中含有对AgNPs生成起重要作用的成分。而通过pH对AgNPs生成的影响发现，pH 11条件下生成AgNPs的产率最高，但是此时(样品III)表观活化能却最高，为119.82 kJ/mol，说明pH的升高影响了FV-CFF中的还原成分，使其反应难度升高，但反应效率大大提升。而冻融后的样品尽管离心除去了絮状不溶物，但在pH 11(样品IV)时的表观活化能却是最低的，仅为80.21 kJ/mol，说明pH的提高大大增加了FV-CFF中剩余组分的还原力，使反应更容易发生。

表3 不同处理条件下FV-CFF反应生成AgNPs的动力学参数Table 3 Kinetic parameters of AgNPs formation by CFF under different conditions

2.3 FV-CFF的成分分析及还原力测定

2.3.1 冻融前后FV-CFF的成分分析

通过对冻融前后的FV-CFF样品进行成分分析可知(表4)，初始FV-CFF样品(即样品I)中总蛋白、总糖及可溶性固形物含量均高于冻融后除去不溶物的FV-CFF样品(即样品II)。样品II中总蛋白和总糖含量降低明显，分别减少了22.24%和11.56%，结合可溶性固形物的含量变化(降低37.74%)可知，冻融后除去的絮状不溶物主要为蛋白质和多糖等大分子组分，这可能是导致样品II反应生成AgNPs活化能升高的主要原因。由表4还可看出，样品中还原糖含量较低，仅为4 μg/mL左右，且冻融对还原糖含量的影响不显著。

表4 冻融前后FV-CFF样品(pH 7.22)的成分分析Table 4 Composition analysis of initial and thawed FV-CFF (pH 7.22)

2.3.2 冻融及pH对FV-CFF还原力的影响

冻融及pH对FV-CFF还原力的影响如图7所示，样品I和样品II的还原力分别为0.075和0.073，说明冻融实验虽然除去了较多蛋白和多糖等大分子可溶性固形物(表4)，但起还原作用的主要成分并未受到显著影响，因此冻融前后FV-CFF样品(pH 7.22)的还原力几乎没有变化。但是，pH的升高则显著提升了FV-CFF样品的总还原力，在pH 11时样品III和样品IV的还原力分别提升至0.20和0.18，说明碱性pH显著激活了FV-CFF中起还原作用的成分，使其还原力大幅提升。

图7 不同处理条件下FV-CFF的总还原力Fig.7 Total reducing power of FV-CFF under different conditions注：Vc作为阳性对照，质量浓度为20 mg/L

2.4 产物AgNPs的表征

2.4.1 不同条件下生成AgNPs的UV-Vis光谱特征

由图8可知，冻融实验虽然会对FV-CFF生成AgNPs的能力产生显著影响，但不会改变产物的吸收波长，而pH的变化则可明显降低产物AgNPs的最大吸收波长。pH 11时，AgNPs的最大吸收波长由pH 7.22时的442 nm降低为411 nm，接近标品的UV-Vis吸收。

图8 不同处理条件下 FV-CFF生成AgNPs的紫外-可见吸收光谱图Fig.8 The UV-Vis absorption of AgNPs formation under different processed FV-CFF

2.4.2 产物AgNPs的形貌

采用TEM观测不同条件下FV-CFF与AgNO3反应生成AgNPs的形貌特征，结果如图9所示。通过ImageJ软件分析图中颗粒尺寸可知，样品I和样品II反应产物的粒径范围均在2.2～10.5 nm，平均粒径分别为5.5和5.4 nm。样品III反应产物的平均粒径最大，为5.6 nm，但粒径范围相对较小，为2.9～9.4 nm；样品IV反应产物的平均粒径最小，为4.8 nm，但分布范围最广(1.5～10.1 nm)。此外，由图9可知，不同FV-CFF样品反应生成的AgNPs颗粒虽然多数为球形，但也有部分不规则的椭球形和多边形存在。这些纳米颗粒多数以少量聚集的状态存在，而且聚集颗粒的边缘可观测到明显的浅灰色暗影，推测是FV-CFF中的大分子成分起到了稳定剂的作用，使AgNPs在溶液中以聚集态存在。

图9 FV-CFF在不同条件下生成AgNPs的TEM图Fig.9 TEM images of AgNPs formation under different conditions in FV-CFF

2.4.3 样品及产物的粒度分布

产物溶液的粒径分析结果(表5)与TEM结果差异较大，这是由于FV-CFF中的大分子成分在溶液状态具有良好的分散和水化作用，使检测结果偏大。此外，由TEM分析可知，由于FV-CFF中大分子的包裹和稳定作用，AgNPs存在颗粒聚集的情况，在溶液状态下易被作为一个整体的颗粒测定，因此最终测定的粒径均大于TEM中观测到的单个纳米颗粒的粒径。

反应前不同FV-CFF溶液的平均粒径显著高于相应样品反应后的结果，说明FV-CFF在与AgNO3加热反应的过程中不仅生成了AgNPs，还使原来溶液中较大颗粒的成分紧密地包裹在银纳米颗粒的周围，起到了稳定作用，因此所生成的溶液无聚沉现象。反应后所生成的AgNPs溶液的平均粒径随pH升高而显著降低，而冻融实验则对产物平均粒径的影响不显著，说明碱性环境能降低FV-CFF中大分子成分之间的聚集，使溶液体系中的颗粒尺寸更低，也更为稳定。pH 11时FV-CFF反应生成AgNPs的Zeta电位值均高于pH 7.22时，颗粒之间存在更强的静电排斥[7]，表明pH 11时制备的AgNPs具有更好的稳定性。此外，反应后生成的AgNPs溶液的多分散系数PDI均大于0.4，说明AgNPs溶液虽然具有良好的稳定性，但属于多分散体系[16]，这与TEM分析结果(图9)一致。

表5 FV-CFF在不同处理条件下反应前后的粒度分布Table 5 Size distribution of different processed FV-CFF samples and the resulted AgNPs

3 结论

本研究选用金针菇菌丝体作为研究对象，采用液态发酵的方式，探究AgNPs的合成效果及影响因素。结果显示，FV-CFF对AgNO3具有明显的还原效果，可生成棕褐色AgNPs稳定溶液。此外，pH对FV-CFF生成AgNPs具有显著的影响，在pH 5～11范围内，AgNPs的产量基本呈线性增加趋势。通过等温动力学实验发现，较高的pH对无菌水发酵液生成AgNPs具有显著的提高效果，而冻融后除去的絮状不溶物也对AgNPs的合成具有一定贡献。本实验合成AgNPs所用的还原剂及稳定剂为金针菇的无细胞滤液(FV-CFF)，主要成分除蛋白质和碳水化合物外还含有许多未知组分，可采用可溶性固形物含量进行定量。冻融前后的成分分析及还原力测定结果显示，冻融后除去的絮状不溶物对还原力的影响有限。而pH升高至11时，还原力则大幅提升，使所生成的AgNPs具有较低的紫外可见吸收波长(411 nm)和较小的溶液粒径(～35 nm)，而冻融实验对这两方面的影响较小。本研究合成AgNPs的方式简单、安全、环保，且具有反应条件温和、易于实现的优势，对于进一步解析金针菇发酵产物合成稳定AgNPs的机制具有重要的指导作用。然而，金针菇无细胞滤液中成分较为复杂，当前研究虽然发现其具有良好的AgNPs合成和稳定效果，但仍未能确认其中起还原作用的关键物质，今后需进一步分析并确认该成分，并解析其还原力受pH影响的机制。