预知子醇提物联合雷公藤红素对SMMC7721 细胞增殖和凋亡的影响

吴晓，卢文丽，张夜航，方肇勤

上海中医药大学基础医学院，上海 201203

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）发病快，致死率高，其难以治愈的关键点在于癌细胞增殖迅速，且拥有抵御不同药物干预的复杂分子应激网络。本课题组长期以来沿治法-方药-单味中药-中药有效组分-有效组分配伍思路不断深入，从肝癌临床常用清热解毒、行气活血、健脾益气等治法及其代表性复方，以及各治法指导下常用中药，通过大量体内、体外实验，筛选出行气活血治法代表中药预知子（Akebia Fructus），发现其能有效抑制不同肝癌细胞恶性增殖，其机制包括选择性诱导癌细胞发生严重内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）等途径，且与遗传霉素、阿霉素、丝裂霉素、博来霉素等药物使用后存在减量增效效应[1-10]。上述研究为预知子联合其他中药/成分奠定了良好基础。本研究观察预知子提取物联合雷公藤红素对肝癌细胞增殖的影响，并通过细胞形态观察、细胞凋亡检测等对分子机制进行初步探索，以期有助于发现肝癌有效治法方药，逐步明确其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

SMMC7721 人肝癌细胞株，购自中国科学院上海细胞所。细胞置于10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素-链霉素的RPMI 1640 培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每3～4 d 传代1 次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2 药物

预知子饮片及醇提物均为课题组前期制备，-80 ℃分装保存，依据2015 年版《中华人民共和国药典》对其主要成分完成超高效液相色谱-高分辨质谱（UPLC-HRMS）分析，饮片购自上海康桥中药饮片有限公司。60 ℃干燥过夜，粉碎，10 倍体积75%乙醇浸泡2 h，80 ℃回流2 次，每次2 h，合并回流液，过滤，浓缩，调pH 值至7.0，定容至含原药材1 g/mL，超滤除菌，分装后于-80 ℃保存备用。雷公藤红素，美国MCE 公司，批号20552。

1.3 主要试剂与仪器

RPMI 1640 培养基（批号31318005）、胎牛血清（批号 35081004）和 0.25%胰酶-EDTA（批号10519010），美国Corning 公司；噻唑蓝（MTT，批号MKBH9792V），美国Sigma-Aldrich；二甲基亚砜（DMSO，批号20181221），上海国药集团化学试剂有限公司；PageRulerTM预染蛋白 ladder（批号00792185），美国Thermo Scientific 公司；β-actin 鼠抗（批号85r7978），美国Affinity Biosciences 公司；葡萄糖调节蛋白78 兔抗（Grp78，货号3177S），美国CST 公司；鼠抗Caspase-3（货号9668T），美国CST公司；Bax、Bcl-2、SQSTM1/p62、Chop、LC3B、Mfn2，英国Abcam 公司，批号分别为GR256474-1，GR255451-4、GR3241806-3、GR3181295-8、GR3264793-4 和GR3268716-3；细胞凋亡Hoechst 染色试剂盒（批号022519190524），上海碧云天生物技术有限公司；青霉素-链霉素（货号C0222）、HRP-IgG（H+L）山羊抗兔（货号A0208）、HRP-IgG（H+L）山羊抗小鼠（货号A0216）、RIPA 裂解液（货号P0013C）、PMSF 蛋白酶抑制剂（货号ST506）、BeyoECL Plus 超敏ECL 化学发光试剂盒（货号P0018S），上海碧云天生物技术有限公司。CP2250 分析天平（德国Sartorius 公司），MH-1 摇床（海门其林贝尔仪器），Model 310 CO2培养箱（美国Thermo Scientific 公司），1300 SERIES A2 生物安全柜（美国Thermo Scientific 公司），ELX-800 全自动酶标仪（美国BioTek Instruments 公司），XDS-1B 倒置显微镜（重庆光学仪器厂），AxioImager M2 荧光显微镜（德国Zeiss 公司），PowerPacTMBasic 电泳仪及配套电泳槽（美国Bio-Rad 公司），170-3930 小型湿转槽（美国Bio-Rad 公司），HPS RT2 Advanced 加热磁力搅拌器（美国Thermo Scientific 公司），FluorChem E 化学发光高灵敏度凝胶成像与分析系统（美国Protein-Simple公司）。

1.4 MTT 法检测细胞存活率和72 h IC50

将细胞接种于96 孔板，待细胞融合率达30%～40%，以不同浓度预知子醇提物（2.0、1.6、1.2、0.8、0.4 mg/mL）、雷公藤红素（1.5、1.25、1、0.75、0.5，0.25 μmol/L）分别作用于细胞，另设空白对照组（有细胞，无药物干预），每组设8 个复孔。72 h 后进行MTT 检测。吸弃原培养液，加入0.5 g/L MTT 溶液200 μL，继续培养4 h，吸弃MTT 溶液，按150 μL/孔加入DMSO，避光振摇10 min，于酶标仪波长570 nm处检测各孔吸光度（A），计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（A用药组－A空白孔）÷（A空白组－A空白孔）×100%。实验至少重复3 次。计算IC50。

1.5 药物相互作用指数

根据获得的72 h IC50对药物剂量适当调整。将细胞接种于96 孔板，待细胞融合率达30%～40%，设置空白对照组、预知子醇提物组（2.0 mg/mL）、雷公藤红素组（1.0 μmol/L）、预知子醇提物＋雷公藤红素组（联合组，预知子2.0 mg/mL＋雷公藤红素1.0 μmol/L）。分别加入相应药物，培养72 h，光镜下迅速拍照，并完成MTT 检测。计算各组存活率并计算药物相互作用指数（coefficient of drug interaction，CDI）。2 种药物组合后细胞存活率用AB 表示，单个药物细胞存活率用A 或B 表示，CDI＝AB/（A×B）。0.7≤CDI＜1表示协同，CDI＜0.7 表示显著协同，CDI＝1 表示相加，CDI＞1 表示拮抗[11-13]。实验至少重复3 次，每次同时设置3 块复板。

1.6 细胞凋亡相关形态观察

取洁净已灭菌盖玻片置于6 孔板，接种细胞培养过夜，融合率为40%～50%。次日给药，72 h 后吸尽培养液，加入0.5 mL 固定液，固定10 min；去固定液，PBS 洗涤2 次，每次3 min，洗涤时用摇床晃动；吸尽液体，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，染色5 min；去染色液，PBS 清洗2 次，每次3 min；吸尽液体，滴加抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡；荧光显微镜下可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350 nm，发射波长460 nm。

1.7 Annexin V-FITC/PI 检测细胞凋亡

收集细胞悬液，PBS 洗涤1 次，将PBS 一并收入相应离心管；胰酶消化细胞，完全培养基终止消化，吹打细胞，收集至对应离心管；1000 r/min 离心5 min，弃除上清液；PBS 清洗2 次，再以1×结合缓冲液洗涤细胞1 次；以1×结合缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为1×106～5×106个/mL；转入流式管，每管100 μL 细胞悬液，加5 μL Annexin V-FITC，室温避光孵育15 min；再加入3 μL PI，室温避光孵育10 min；每管中添加400 μL 预冷的PBS，2 h 内上机测试完毕。数据采用FlowJo VX 软件进行分析。

1.8 Western blot 检测相关蛋白表达

RIPA 裂解液裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液测定蛋白浓度；蛋白上样量约30 μg，SDS-PAGE 胶浓度为10%～12%，蛋白转移至0.45 μm PVDF 膜上，5%BSA 室温封闭2 h 后，Bax（1∶2000）、Bcl-2（1∶2000）、Caspase-3（1∶1000）、Grp78（1∶1000）、Chop（1∶2500）、p62（1∶2000）、LC3B（1∶20 000），Mfn2（1∶5000）一抗4 ℃孵育过夜，二抗（1∶1000）室温孵育1 h，BeyoECL 显色后采用FluorChem E 凝胶成像与分析系统获得条带，以β-actin 作为内参，采用Image J 计算各条带灰度值。

1.9 统计学方法

采用SPSS19.0 统计软件进行分析。所有数据以表示，多组间两两比较，方差齐用LSD法，方差不齐采用Tamhane’s T2（M）检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单药预知子醇提物或雷公藤红素对SMMC7721细胞存活率的影响

由图1、图2 可知，随着药物浓度的增加，细胞存活率均呈下降趋势。预知子醇提物72 h IC50为2.07 mg/mL，雷公藤红素72 h IC50为0.92 μmol/L。为便于后续实验开展，根据IC50对药物剂量做适当调整，预知子醇提物采用2.0 mg/mL，雷公藤红素采用1.0 μmol/L 用于后续实验。

图1 预知子醇提物对SMMC7721细胞存活率的影响（，n＝8）

图2 雷公藤红素对SMMC7721细胞存活率的影响（，n＝8）

2.2 预知子醇提物和雷公藤红素相互作用指数

预知子醇提物组、雷公藤红素组较空白对照组细胞存活率显著下降（P＜0.05），联合组较预知子醇提物组、雷公藤红素组细胞存活率显著下降（P＜0.05），见表1。同时，依据存活率数值计算2种药物CDI均值为0.45，按标准[11-13]视为具有显著协同效应。

表1 各组SMMC7721细胞存活率比较（）

表1 各组SMMC7721细胞存活率比较（）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与预知子醇提物组比较，#P＜0.05；与雷公藤红素组比较，▲P＜0.05

2.3 单药及联合对SMMC7721细胞形态的影响

预知子醇提物组细胞增殖被抑制，出现空泡（箭头所示）；雷公藤红素组细胞增殖抑制现象明显，细胞形态与预知子醇提物组区别明显；联合组细胞增殖抑制更显著，视野下可见细胞数量明显减少。见图3。

2.4 单药及联合对SMMC7721细胞凋亡的影响

与空白对照组比较，预知子醇提物组细胞核无明显变化；雷公藤红素组个别细胞出现核固缩现象(箭头所示)；联合组细胞核数量显著减少，且部分细胞核呈碎块状。见图4。

图3 各组SMMC7721细胞形态（×100）

图4 各组SMMC7721细胞核形态（Hoechst 染色，×400）

2.5 单药及联合对SMMC7721细胞凋亡率的影响

与空白对照组比较，预知子醇提物组和雷公藤红素组细胞凋亡率降低；联合组细胞凋亡率增加，较其余3组差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

2.6 单药及联合对SMMC7721细胞线粒体凋亡途径蛋白表达的影响

各组Bax 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组比较，雷公藤红素组Bcl-2蛋白表达降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；雷公藤红素组和联合组Caspase-3蛋白表达明显降低（P＜0.05）；联合组cleaved Caspase-3蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与雷公藤红素组比较，联合组Bax/Bcl-2比值明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

2.7 单药及联合对SMMC7721细胞内质网应激途径蛋白表达的影响

与空白对照组比较，预知子醇提物组Grp78蛋白表达明显降低（P＜0.05）；雷公藤红素组和联合组Grp78蛋白表达明显升高（P＜0.05）；联合组Chop蛋白表达明显高于其余3 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图7。

图5 各组SMMC7721细胞凋亡率比较（，n＝4）

图7 各组SMMC7721细胞Grp78、Chop蛋白表达比较（，n＝3）

2.8 单药及联合对SMMC7721细胞自噬相关蛋白表达的影响

与空白对照组比较，预知子醇提物组和联合组p62、LC3BⅡ蛋白表达及LC3BⅡ/Ⅰ比值均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而雷公藤红素组上述各指标均无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图8。

2.9 单药及联合对SMMC7721细胞线粒体-内质网偶联结构相关蛋白表达的影响

与空白对照组比较，预知子醇提物组、雷公藤红素组和联合组Mfn2蛋白表达均有所上调，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图9。

图8 各组SMMC7721细胞p62、LC3B蛋白表达比较（，n＝3）

图9 各组SMMC7721细胞Mfn2蛋白表达比较（，n＝3）

3 讨论

近年来，对于疾病-靶点-药物的常规治疗策略已逐渐转向多种活性成分的联合疗法。这种模式的转变，与单药治疗在慢性病、耐药性及不良反应等方面的局限性有关。同时，越来越多的证据表明，联合/协同疗法在应对病因和病理生理学特征复杂的疾病，如恶性肿瘤时具有更强的疗效优势，也深化了对疾病治疗靶点和潜在多靶点的认识[14-15]。

以上发展趋势同样体现在中医药研究领域。如针对肝癌患者脾气虚弱、气滞血瘀、痰热邪毒等常见证候，相应给予健脾益气、行气活血、清热解毒等治法及方药。中药复方及其加减含有多种成分，本身已是联合/协同用药的表现形式之一。在此基础上，围绕肝癌治疗领域的常用治法、方药，开展处方优化、中药配伍及其作用机制研究，符合肝癌临床治疗方案协同发展需求。行气活血中药预知子的筛选，建立在本课题组早期针对肝癌患者常见证型开展的大样本流行病学调查[16-18]，以及治疗所使用的中药复方用药规律的回顾性分析的基础上[19-21]。预知子在抑制多种肝癌细胞增殖方面效果突出，细胞出现典型的ERS形态学改变，ERS等通路基因差异表达活跃[1-10]。预知子特有的作用及机制，为其联合/协同其他中药/成分奠定基础，并提供思路和选项。

本研究结果显示，在明确预知子醇提物和雷公藤红素72h IC50后，二者联合使用抑制SMMC7721细胞增殖存在显著协同效应，诱导凋亡作用增强、确切。进一步观察细胞形态发现，预知子醇提物作用后，细胞形态出现ERS样变化，如发生空泡现象，与以往研究[6，9]一致，但对细胞核影响不明显；雷公藤红素作用后，细胞出现核固缩现象；二者联合使用后，细胞数量显著减少，且视野下细胞核呈碎块状。形态学结果提示，二者联合后诱导凋亡有增强迹象。进一步通过流式细胞仪检测发现，预知子醇提物和雷公藤红素各自单独给药时凋亡现象并不明显，联合使用显著诱导凋亡发生（早期凋亡率和晚期凋亡率），故进一步探索二者联合作用的分子机制。

研究表明，雷公藤红素具有多种药理活性[22]，如可致肝癌细胞内在线粒体凋亡通路激活，诱导凋亡和自噬[23]；在协同作用方面，雷公藤红素与Bcl-2抑制剂ABT-737可协同抑制肝癌细胞增殖，诱导凋亡，并伴Caspase级联反应激活和线粒体细胞色素C的释放。此外有研究认为，ERS在其中起着不可或缺的作用[24]。综合课题组前期基础和国内外研究进展，本研究继续尝试从线粒体凋亡途径、ERS途径、自噬途径等方面开展机制研究。具体包括线粒体凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及二者比值，Caspase-3和cleaved Caspase-3；ERS相关蛋白Grp78、Chop；自噬相关蛋白p62、LC3B。此外，鉴于线粒体和内质网均为膜性结构且存在紧密连接，可能互相影响，本研究进一步尝试检测线粒体-内质网偶联（MAM）的标志物Mfn2的表达量[25]，尝试提供更多的分子依据。

本研究结果显示，线粒体凋亡途径——经典的Caspase依赖途径方面，对凋亡贡献程度不大；ERS相关蛋白Grp78，自噬相关蛋白p62、LC3B相对活跃；MAM 结构作用还有待研究。具体表现为促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的变化并不明显；进一步结合Bax/Bcl-2比值发现，雷公藤红素组该比值呈升高趋势，但与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Bax、Bcl-2的表达及其比值在肝癌细胞凋亡中被视为具有重要的调控作用[26]，提示雷公藤红素可能与凋亡发生的关联更大。此外，与空白对照组比较，各给药组Caspase-3和cleaved Caspase-3表达量总体呈下降趋势，且以联合组最明显（P＜0.05）。与空白对照组比较，雷公藤红素组和联合组Grp78蛋白表达均明显升高（P＜0.05），且联合组表达量较单药组升高更明显（P＜0.05）；单药组Chop蛋白表达变化不明显，联合组表达明显升高（P＜0.05），提示二者有协同效应。与空白对照组比较，预知子醇提物组、联合组p62、LC3BⅡ蛋白表达显著升高（P＜0.05），而2组间无明显差异，雷公藤红素组无明显变化。MAM结构标志物Mfn2各组间差异无统计学意义。由于本次仅检测了MAM结构的一种分子，其他标志物如Drp1等均未涉及，不可避免存在局限性。就入选的4种途径9个蛋白分子而言，预知子醇提物和雷公藤红素作用靶点不尽相同；二者一致性效应机制方面，除Caspase-3和cleaved Caspase-3、Chop和Mfn2等分子外，尚需进一步关注其他介导凋亡信号的途径或分子。

综上，本研究明确了预知子醇提物和雷公藤红素联合抑制SMMC7721 细胞增殖、诱导凋亡的一致性效应，并对分子机制进行了初步探索。但二者各自及联合作用的具体机制仍有待今后深入挖掘。