小球藻遗传转化技术研究进展

曹苏珊，薛 静，王倩楠，张秀海，安贤惠

(1.江苏海洋大学 海洋生命与水产学院，江苏省海洋生物资源与生态环境重点实验室，江苏 连云港 222005；2.北京市农林科学院，北京农业生物技术研究中心，北京 100097)

小球藻(Chlorella)是一种单细胞真核藻类，属绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、小球藻科、小球藻属[1]。作为最早开发的真核微藻之一，具有高营养价值、生长快速、结构简单、易工业化集成等显著优点。其细胞形态为球形或椭圆形，直径3～12 μm，呈单生或聚集成群状生长[2]，分布广泛，多见于淡水、咸水和土壤中。作为地球上最早的生命之一，小球藻基因比较稳定，至今未见有关其基因自发突变的报道。因其富含蛋白质、脂质、维生素、活性代谢产物等多种营养物质而被公认为具有高附加值和医疗保健作用，已经被广泛应用于保健食品[3]、水产养殖[4]、生物能源[5]等方面，关于小球藻生物技术的研究主要集中在基因组学[6]、分子遗传学[7]、代谢机理[8]、大规模培养[9]等方向。

小球藻具有通过基因工程表达外源基因进而规模化生产外源蛋白的潜在特质，而且具有低成本、环境友好等优势，用于真核生物基因表达前景广阔[10-12]。我国常见培养的小球藻种类有蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)、椭圆小球藻(C.ellipsoidea)和普通小球藻(C.vulgaris)[13]，都可作为优质的蛋白来源，同时也是进行生物技术研究的良好材料。截至目前，据不完全统计，有超过12种小球藻实现了遗传转化[14]。

1 小球藻遗传转化影响因素

1.1 转化受体的预处理

小球藻的细胞壁主要是由微纤维和基质构成，主要成分是蛋白质、纤维素、葡糖胺以及脂质等。研究者在电镜下观察到小球藻表面由直径为3～5 nm的微纤维不规则地交织在连续网络状的细胞壁上，将整个基质包围。微纤交织维贯穿于整个细胞壁，并沿两个不同的方向延伸，夹角近似为直角。基质外表面为颗粒状，电镜检测和酶处理显示，这些颗粒主要分布在细胞壁外表面和细胞壁内表面[15]。这一方面为细胞提供了强大的防御能力，另一方面也导致小球藻细胞壁较厚且硬、成分复杂、难以轻易去除，在一部分转化方法中需要先通过弱化细胞壁形成原生质体从而提高遗传转化效率[16-17]。小球藻原生质体主要通过物理方法如研磨法、超声波法或者生物方法如酶解法来制备[15]。研磨法和超声波法因为需要通过物理因素来施加外力，导致小球藻死亡率升高，不利于后续对小球藻的进一步利用；而酶解法通过利用温和的生物方法更有利于制备原生质体，以获得高活力与高收获率的原生质体为前提，结合不同的转化方法使转化效率得到提升。

目前小球藻原生质体的制备并未达到成熟阶段[18]。由于小球藻细胞壁成分复杂多样，利用单一种类的酶对细胞壁进行酶解并不能达到理想效果，研究者开始利用不同种类的酶以不同比例混合对小球藻细胞进行酶解，以期达到良好的原生质体获取率。早在1982年，Yamada等[19]已经成功制备出小球藻原生质体，并发现不同藻株之间细胞壁结构可能存在差异；Hatano等[20]以酶液混合物获得椭圆小球藻的原生质体；Cho等[21]用纤维素酶对小球藻进行酶解处理，也可以有效去除细胞壁；Kumar等[22]先对小球藻酶解后再进行电击转化，成功将青色荧光蛋白(CFP)基因和绿色荧光(GFP)基因在其中进行整合表达。也有研究者通过在培养基中添加2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)增加细胞通透性，以此更高效制备原生质体。谢伟民等[23]发现，经过2-DG预培养的小球藻酶解处理获得的原生质体转化效率明显高于未经2-DG预培养的小球藻原生质体。陈波[24]将普通小球藻在酶解前用2-DG预处理，得到了37%的原生质体形成率。

1.2 选择标记的筛选

在小球藻基因转化系统中，选择合适的选择标记基因十分关键。目前的选择标记基因缺乏多样性，通常使用抗生素进行标记筛选，利用对受体细胞致死的抗生素培养基来选择含有抗生素抗性基因的质粒稳定转染细胞。小球藻中常用的选择标记基因主要包括nptⅡ(产生G418、卡那霉素、新霉素抗性)[25]、ble(产生博来霉素抗性)[17]、hpt(产生潮霉素抗性)[26]和cat基因(产生氯霉素抗性)[27]。部分常用抗生素对不同小球藻最佳作用质量浓度见表1。

在小球藻的筛选中要本着筛选标记对小球藻的作用剂量小、除菌效果良好且对小球藻生长不产生影响的原则，以提高筛选效果[35]。综合目前研究可见，试验中常用的筛选标记是G418和潮霉素，但不同种类并不完全一致(表1)。

表1 部分抗生素对不同种类小球藻最佳作用质量浓度Tab.1 The optimal concentration of some antibiotics for different species of green alga Chlorella

1.3 转化方法的选择

Jarvis等[37]于1991年首次利用聚乙二醇(PEG)融合法在椭圆小球藻中成功表达出荧光素酶。Dawson等[38]于1997年在硝酸还原酶基因缺失的小球藻(C.sorokiniana)突变藻株中利用粒子轰击的方法将硝酸还原酶基因导入宿主并且表达，得到了可以在硝酸盐环境中生长的转化株。当前研究对小球藻经常使用的转化方法主要为农杆菌(Agrobacterium)介导法[32]、电击法[26]、粒子轰击法[39]以及PEG融合法[37]。分别简要阐述4种转化方法及其优缺点，同时分析并展望新型转化方法。

1.3.1 农杆菌介导法

农杆菌介导的遗传转化已经在部分微藻中成功应用，是一种可行的小球藻转化方法。这种方法通常在植物中表现为低基因拷贝数的高比例转化[40]。作为一种自然界中天然存在的转化方法，农杆菌介导法对设备要求低、转化效率高、外源基因易整合，但转化过程中操作步骤复杂、转化后小球藻需要进行除菌处理。

Cha等[32]等使用含有绿色荧光蛋白基因∶β-葡萄糖苷酸酶基因(GFP∶GUS)的融合报道基因和花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子驱动的潮霉素磷酸转移酶的二元载体pCAMBIA1304通过农杆菌在小球藻中进行表达，在确定乙酰丁香酮含量、农杆菌与藻细胞共培养时间、温度等条件后，得到25%GUS阳性藻细胞。在Ma等[25]的研究中，透明颤菌血红蛋白基因(vgb)也通过农杆菌介导的方法被转入小球藻中，明显改善了小球藻的细胞生长和叶黄素产量。Lou等[16]将β-胡萝卜素羟化酶基因(crtRB)和玉米黄素剪切双加氧酶基因(ZCD1)利用农杆菌在小球藻中表达，使其可以产生藏花酸。目前农杆菌介导的转化体系的影响因素主要包括：小球藻预培养时间、农杆菌状态和含量以及共培养的条件等，可以通过优化以上参数提高转化效率[32]。

1.3.2 电击法

电击法是小球藻转化系统中较为常用的转化方法。此方法是利用外界的物理力量，在适当的条件和含量下通过对细胞施加短时间的高强度电场而打开短时间的微孔，从而达到将外源基因运送到细胞中并且进行基因整合的目的。电击转化过程中缓冲液浓度、藻细胞培养周期、DNA浓度等因素均对转化效率有重要的影响[41]。

牟云等[42]通过构建电击转化体系在沙漠小球藻中成功表达人乳铁蛋白。Zhang等[43]通过电穿孔的方法将来自大豆的转录因子GmDof4基因转化到小球藻中，脂质含量显著提高46.4%～52.9%。另外，在一些研究中，为了防止可能出现因小球藻细胞壁较厚而导致转化效率偏低的情况，制备原生质体再进行电穿孔也是一种可行的方法[22]。电击法操作相对简单、转化效率高且具有可重复性。虽然电击法因其高强度的电场可以瞬间将外源基因导入细胞中，但一些情况下因其电场强度过高也可能出现细胞转化偶然性、细胞死亡率升高的情况。因此，电场强度的控制十分重要。

1.3.3 聚乙二醇融合法

聚乙二醇融合法是一种简单有效的转化方法。主要是将包括外源DNA、小球藻原生质体、聚乙二醇和玻璃珠混合在一起进行搅拌。借助聚乙二醇将原生质体暴露于外源DNA中，促进DNA渗入细胞中。该方法与电击法相比转化效率相对较低[44]，但因其操作简单、成本低廉且不需要专门的设备，仍具有一定优势。

在一些小球藻中，已经利用该方法进行转化表达。Yang等[45]通过表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)成功构建聚乙二醇介导的小球藻转化体系。Hawkins等[46]曾采用聚乙二醇转化法将人生长激素基因(hGH)在小球藻中进行了瞬时表达，并检测到hGH表达量有所提高。

1.3.4 基因枪法

基因枪法是一种广泛使用和有效简单的可重复的转换方法。这种方法几乎适用于所有类型，包括细胞壁坚硬的小球藻。该方法将外源DNA包裹在微米级的钨粉或金粉中，然后在真空状态下通过粒子轰击枪加速对受体细胞进行轰击，实现外源基因的转化[38]。一些研究证明粒子轰击对小球藻的转化有效，El-Sheekh等[47-48]分别在小球藻(C.kessleri)和椭圆小球藻中成功表达GUS基因。

基因枪法主要受轰击压力、轰击距离、载体情况及DNA含量等因素影响[47]。这种方法操作简单、试验周期短，但其局限性在于使用仪器昂贵、转化效率偏低，而且考虑到小球藻的直径为3～12 μm，需要使用较小尺寸的微粒使其更容易进入小球藻细胞内。

1.3.5 纳米磁珠转化法

随着生物技术与物理技术迅速交叉发展，纳米技术在生物领域的应用越来越广泛，具有基因运载功能的纳米载体已经成功运用到动物细胞、医学等领域。纳米磁珠传递法作为一种新型转化方法，主要表现为纳米磁性颗粒携带核酸在磁力作用下进行磁力传递，在短时间内将目的基因递送至靶细胞，目前纳米载体表现出转染效率高、操作方便等优点[49]。美国爱荷华州立大学的科学家首次报道利用纳米二氧化硅多孔颗粒装载基因及表达调控物质，成功转化植物细胞，并获得转基因植株[50]。我国研究者通过纳米磁珠介导法成功将外源基因在棉花[49]、牡丹[51]等植物中转化表达。本实验室开展了利用不同粒径的纳米磁珠对小球藻进行遗传转化的研究，得到了外源基因成功表达的阳性藻株(待发表)，同时为小球藻的转基因方法提供了一个新的思路。

1.4 基因表达元件

小球藻遗传转化研究中通常使用的外源性启动子有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子[25,52-53]。玉米多聚泛素蛋白Ubiquitin和水稻肌动蛋白Actin也逐渐应用于促进外源基因在小球藻中的表达[17,43,54]。诱导型启动子也在不断地用于小球藻转化表达的试验中，Niu等[27]鉴定了来自三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的编码硝酸还原酶(NR)基因的启动子，其可以在作为唯一氮源的硝态氮存在下驱动转化的cat报告基因在小球藻中的诱导型表达。刘晓鹏[55]在吲哚乙酸(IAA)诱导条件下，利用应答植物生长素信号的DR5启动子驱动GFP在小球藻内实现表达。

小球藻自身的内源性启动子同样具有驱动小球藻转化表达的功能。Liu等[56]证明，小球藻八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因启动子、硝酸还原酶(NIT)基因启动子和来源于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(RBCS)基因启动子均能成功驱动PDS基因在小球藻表达。小球藻病毒启动子也能够驱动外源基因在小球藻中表达[57]。因此可以不断开发小球藻病毒作为高效启动子的重要来源来进行关于小球藻转化的深入研究。

增强子可以激活靶启动子的转录，和启动子共同作用强化外源基因表达。Chen等[58]研究了5种不同启动子对GUS基因转化小球藻的影响，发现与来自烟草花叶病毒的Ω增强子串联的Ubiquitin启动子驱动GUS基因在小球藻中的表达效率高于其他启动子，证明增强子可以增强小球藻的外源基因表达。一部分内含子也可能起到增强表达的功能，Liu等[56]在提高小球藻表达虾青素含量的研究中发现，保留PDS基因的第一个内含子可以提高91%的表达效率。

随着对小球藻研究的不断深入，发现除了高效的转化方法、转化载体，外源基因插入后小球藻对外源基因的整合、转录等表达调控过程同样对转化结果产生影响[43]。由于小球藻基因工程起步晚，当前对小球藻中基因表达调控的机理尚未完全清楚，因此外源基因插入的机制、遗传表达的修饰等问题是当前值得探讨研究的重要方向。

2 外源蛋白表达

当前利用小球藻作为生物反应器使外源蛋白进行高效表达并未达到产业化生产规模，主要原因是外源蛋白表达不稳定、表达产量不够高甚至是微量的。因此目前的研究主要集中在利用不同方法转化的外源基因表达量及其生物活性分析[59-60]。一些不同外源蛋白在小球藻中表达含量的差异见表2。

表2 不同外源蛋白在小球藻中表达量Tab.2 Expression of different exogenous proteins in green alga Chlorella

当前已经有越来越多不同种类外源蛋白成功在小球藻中进行表达，并呈现出一定活性(表2)，这证明小球藻在不同领域均具有巨大的潜力，同时提高外源基因在小球藻中的表达活力也成为一项必不可少的工作。

3 展 望

作为一种应用前景广泛的工业藻种，近年来关于外源基因在小球藻中转化表达的研究不断更新，丰富了小球藻生产有价值化合物的可能性。目前小球藻遗传转化工作还存在以下瓶颈有待解决：(1)小球藻遗传信息与种质信息不够清晰；(2)转化体系和方法有待进一步优化；(3)外源基因插入的表达调控机制对外源蛋白表达的影响。

对于外源基因在小球藻中高效表达体系的完善，可以从不同方面进行：(1)研究小球藻物种的遗传信息、对小球藻自身功能性基因的克隆与分析，并将小球藻自身的一部分基因应用于其他高等植物或者微藻中的研究，有利于推进小球藻遗传转化的进程[62]。同时扩大当前已有的小球藻种类信息，获得优质小球藻藻种，并从中发现更具应用价值的物种，同样可以加快小球藻生物技术的研究速度。(2)通过优化现有转化体系参数及开发新型小球藻转化方法改善外源基因在小球藻中的表达效果。在转化过程中开发利用新型高效启动子、增强子等相关元件，制备高活力原生质体，对转化方法中的关键步骤进行工艺改善，以及对转化成功的藻种发酵条件优化等小球藻转化体系上游和下游工作的改进对于外源基因在小球藻中表达效率的提高十分关键。同时在优化现有转化体系参数的基础上，不断研发安全高效的新型转化方法，可以从不同途径改善小球藻转化过程中存在的不足。将新型纳米载体技术应用于小球藻转化研究中，不但可以简化传统转化方法的操作步骤，同时在提高转化效率方面存在优势。(3)外源基因插入后的转录、翻译、翻译后修饰机制，外源蛋白是否被水解对高效表达产生重要影响。外源基因未表达的情况可能是由于存在多基因整合以及转录基因沉默(TGC)或转录后基因沉默(PTGC)机制，这种机制在其他植物中出现，推测可能在小球藻中也会发生类似情况。外源重组蛋白通常被宿主细胞识别为外来细胞，相比于内源蛋白有可能更快地发生降解[63]，推测小球藻外源基因转化产物产量不高，可能部分是由此造成的。因此，深入探究小球藻转化过程的分子机制有助于清晰外源基因在小球藻中的表达修饰等情况。

小球藻作为外源基因转化宿主具有众多优点，在培养方面，可以在可控制的条件下高密度生长，短时间内积累大量生物活性物质；在应用方面，可以作为健康无毒害的功能食品直接使用，用作表达系统时可以对蛋白进行高水平的翻译后修饰，而且翻译后修饰机制与哺乳动物接近，因此可以用于生产如重组疫苗、抗体等有用物质，应用于水产、医疗等行业，这些使其相比于其他植物具有巨大的竞争优势。因此在优化小球藻转化系统和发展小球藻转化方法等方向不断努力取得良好进展，使其在产业化开发生产上不断推进，在生物技术方面应用更加广泛。