口服间变性淋巴瘤激酶抑制剂X-396对脓毒症病死率和血浆炎症因子表达影响的实验研究

杜 娟,文大林,唐 昊,张华才,陆红祥,蒋建新

(陆军军医大学大坪医院战创伤医学中心，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042)

脓毒症是感染、烧/创伤、休克等危重患者常见的严重并发症之一，进一步可发展为脓毒症休克、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。脓毒症具有高发生率和高病死率的特点，是当今严重战创伤和危重病患者的主要死因[1-4]。脓毒症的发病机制是病原微生物入侵，引发天然免疫细胞释放免疫化学物质，从而触发促炎或抗炎反应，引起器官功能的障碍，甚至死亡。因此，利用药物抑制的方法，调控脓毒症中主要免疫反应的关键炎症调节因子，可能成为一种有效的治疗脓毒症的手段。

有研究报道，某些抗肿瘤的药物对脓毒症的治疗有较好的效果。2017年，Zeng等[5]通过多种人、鼠的细胞研究结果，发现间变性淋巴瘤激酶(ALK)可直接结合表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)，进而通过蛋白激酶B(AKT)活化干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)通路，而ALK的特异性抑制剂—色瑞替尼，可以抑制由STING通路产生的干扰素(interferons,IFNs)介导的免疫应答，从而降低脓毒症小鼠的病死率，提示色瑞替尼是一种潜在的有效治疗脓毒症的药物。

本研究拟采用的X-396，又名恩萨替尼(Ensartinib)，是新开发的一种间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、细胞间质-上皮细胞转化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-Met)等的多靶点二代抑制剂，它是一种于氨基吡啶嗪的小分子，对ALK具有潜在抑制能力[6-8]。因此，本文拟探讨X-396对脓毒症小鼠的保护作用，为临床治疗脓毒症提供新的治疗思路，并奠定研究基础。

材料与方法

1 主要试剂与仪器

X-396(Ensartinib，恩萨替尼，贝达药业股份有限公司)； 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(DTA00D，美国R&D公司)； 干扰素-β(INF-β)ELISA试剂盒(DIFNB0，美国R&D公司)； 白介素-7(IL-7)ELISA试剂盒； 小动物气体麻醉机(VMR，美国Matrx公司)； 独立通气笼(IVC)动物饲养系统(上海天焕科技发展有限公司)。

2 动物模型建立与分组

SPF级C57小鼠157只，体重20～25g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[动物许可证：SCXK(京)2014-0004]。在超净台中进行模型的建立，术中严格无菌操作。切开腹部，找出盲肠端，尽量使粪便分布均匀，盲肠充盈度为厚度0.35～0.4cm，结扎盲肠端1cm长度，结扎后用16G针垂直穿透盲肠1孔，随后将盲肠放回腹腔。缝合腹部切口。之后将模型动物放回IVC动物饲养系统，2只/笼，给予充分食物及饮水，相对湿度40%～70%，光照12h明暗交替，室温20～23℃。按照随机数字法分为对照组和治疗组。治疗组按照给药方式和给药剂量分为：口服组1(10mg/kg)、口服组2(20mg/kg)、腹腔组(10mg/kg)、静脉组(10mg/kg)。实验前禁食12h，不禁水。治疗组于伤后2、24、48、72h，4、5、6、7d根据不同的分组方式每天给予X-396药物1次，对照组以灌胃的方式口服等量对照溶剂。

3 主要检测指标

3.1病死率：模型制作后，伤后0～48h，每2h观察一次动物死亡情况并记录； 伤后48～96h，每3h观察一次动物死亡情况并记录;伤后5～7d，每12h观察1次动物死亡情况并记录。

3.2肺、肾、肝组织HE染色：伤后第3天，分别取对照组和口服组1(X-396 10mg/kg)的小鼠左肺、左肾、肝右叶，依次进行4%多聚甲醛固定，脱水包埋，切片进行HE染色后，光镜下观察各组织病理变化情况。

3.3细胞因子检测：静脉采集30例健康人外周血2mL。将每例血标本分成2组，分别为脂多糖(LPS)刺激组(1mL)、LPS刺激+X-396组(1mL)。刺激浓度LPS 为100ng/mL,X-396 为10μM，37°C，刺激16h。刺激结束后经1 000rpm，离心10min。吸取上层血浆，分装为60μL/管保存于-80°C。应用二喹啉甲酸(BCA)法测定外周血总蛋白含量(具体步骤参照试剂盒说明书)，应用双抗体夹心ELISA试剂盒检测TNF-α、INF-β、IL-7浓度。

4 统计学分析

结 果

1 口服10mg/kg的X-396对脓毒症有明显保护作用

口服药物X-396对小鼠CLP模型病死率具有显著保护效果(P<0.01)。两组在12h内均无动物死亡，口服组1病死率在24h～7d的各个时间点均显著低于对照组，说明X-396能够显著降低脓毒症小鼠的病死率。两组的死亡高峰均集中在24～48h。见表1、图1。

表1 对照组和X-396组病死率比较

图1 对照组和口服组Kaplan-Meier生存曲线

口服X-396的给药途径，对小鼠病死率的保护效果最佳。在CLP模型的基础上，笔者进行了3种给药途径的比较，结果表明：口服组1的病死率在24h～7d的各个时间点均显著低于对照组； 腹腔组的死亡高峰集中在24h和48h两个时间点，各时间点的病死率与对照组差异不明显； 静脉组在24h就出现死亡高峰，且4d的病死率达到100%。结果表明，口服X-396是降低小鼠脓毒症病死率的最佳途径。见表2、图2。

表2 10mg/kg剂量下不同给药途径病死率比较

*P<0.05； #P<0.05； &P<0.05

10mg/kg和20mg/kg的给药剂量相比，二者差异不明显。在前期的研究基础之上，笔者分别对两组CLP小鼠模型进行10mg/kg和20mg/kg的口服X-396治疗，实验结果表明，两种剂量对CLP小鼠的病死率均有保护效应，在24h～7d的各个时间点均显著低于对照组。但两组之间的保护效果差异并不明显，提示口服X-396的较佳计量为10mg/kg。见表3、图3。

表3 不同给药剂量病死率比较

*P<0.05,#P<0.05

2 X-396处理对各组织病理变化的影响

肺组织病理切片显示，对照组为中度炎症及弥漫性肺水肿，肺间隔明显增宽，X-396组为轻度炎症及轻度肺水肿。肾脏病理切片显示：与对照组比较，X-396组炎症反应和肾小管水肿有所减轻； 肝脏病理切片显示：对照组肝小叶、肝窦结构消失，肝细胞肿胀，伴有肝细胞变性坏死，X-396组肝组织结构正常，部分干细胞轻度肿胀，肝小叶结构可见。见图4。

图4 治疗组与对照组肺、肾、肝病理切片比较(HE×200)。a.X-396口服组1第3天的肺轻度炎症和水肿； b.对照组第3天的肺间隔明显增宽，水肿增加； c.X-396口服组1第3天的肾脏肾小管轻度水肿； d.对照组第3天的肾脏肾小管明显水肿； e.X-396口服组1第3天的肝脏肝组织结构正常； f.对照组第3天的肝脏肝窦结构消失，肝细胞肿胀

3 X-396处理后人外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-β(INF-β)、白介素-7(IL-7)水平检测

(1)TNF-α水平：经X-396处理后，外周血TNF-α的表达水平较单纯LPS处理组明显降低[(1091.6±240.2)pg/mLvs. (1590.0±638.5)pg/mL，P<0.01，图5a]。(2)INF-β水平：X-396处理后，外周血INF-β的表达较单纯LPS处理组明显降低[(29.0±8.2)pg/mLvs. (41.8±12.8)pg/mL，P<0.05，图5b]。(3)IL-7水平：经X-396处理后，外周血IL-7的表达水平较单纯LPS处理组明显降低[(5.04±1.11)pg/mLvs. (6.72±1.79)pg/mL，P<0.05，图5c]。提示X-396可以显著降低炎症反应水平，从而对脓毒症起保护作用。

*P<0.05

讨 论

脓毒症的发病机制主要是由于微生物——特别是革兰氏阴性菌入侵机体，刺激机体产生一系列模式识别受体(spattern recognition receptors，PRR)，从而激活了自身的天然免疫系统。不同的天然免疫细胞释放多种化学物质如细胞因子、炎症趋化因子、生长因子，这些物质进一步触发促炎和抗炎的免疫反应，而促炎和抗炎的失衡又会导致器官功能障碍、器官损害，甚至死亡[9]。因此，寻找调控脓毒症中主要免疫反应的关键炎症调节因子，探寻维持天然免疫反应平衡的途径，对脓毒症的治疗至关重要。

前期研究发现ALK是天然免疫蛋白STING的上游调节因子，利用ALK的抑制剂色瑞替尼可以抑制ALK-STING通路的活化，从而抑制宿主对炎症的过度反应，提高对脓毒症的抗性[5，10]。本研究在体实验结果提示，X-396可以降低脓毒症小鼠模型的病死率，故推测X-396可能通过抑制ALK-STING通路的活化，纠正了宿主对感染的过度反应，使小鼠对脓毒症和感染性休克具有更强的抵抗力，提示ALK抑制剂有望成为治疗人类脓毒症的有效手段。

IFN-β、TNF-α以及IL-7均是脓毒症感染的下游炎症因子，IL-7是一种具有免疫效应的淋巴因子，能促进干扰素、肿瘤坏死因子等促炎细胞因子的分泌[11]。TNF-α由包括巨噬细胞在内的多种细胞产生，是一个重要多效细胞因子，在调节免疫反应中可作为促炎因子，启动一系列促炎反应，系统内高水平的TNF-α可导致脓毒症休克[12]。INF-β是一种由天然免疫细胞产生的细胞因子，属于I型干扰素蛋白家族成员，在细菌感染和LPS刺激模型中，I型干扰素蛋白可促进脓毒症休克的发展进程。有研究报道，TNF-β的表达可以增强促炎反应，并扩大LPS引起的内毒素休克[13]。在脓毒症体外实验中，笔者发现，经过ALK的抑制剂处理之后，各促炎因子表达水平明显降低，提示过度的免疫反应得到调节。各组织的病理结果也显示，经过X-396处理后，脓毒症小鼠的肺脏、肾脏、肝脏组织的炎症情况得到明显改善，因此，利用药物阻断ALK-STING信号通路，可能调节了脓毒症的过度炎症反应。

综上所述，本研究发现抑制ALK的活化可以抑制STING通路及其下游促炎因子的过度表达，控制炎症瀑布放大效应，从而降低脓毒症的病死率。但ALK是否直接作用于STING，以及ALK下游的关键调节网络尚未阐明，本研究仅为进一步研究ALK的调控机制及临床应用奠定一定的研究基础。