利用CRISPR/PITCH系统构建表达CSDE1-EGFP的B16细胞株

刘孟雨，周雅博，黄 波，吕家迪

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 免疫学系 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

近几年人们在黑色素瘤(melanoma)免疫治疗和靶向治疗方面取得了一定的进展，提高了转移性黑色素瘤患者的生存率[1-2]。但有研究发现在黑色素瘤细胞中过表达含E1的休克域(cold shock domain containing E1，CSDE1)能够促进肿瘤侵袭和转移[3]。CSDE1属于一种RNA结合蛋白(RNA binging proteins,RBP)，主要在细胞质中表达，能够结合单链DNA和RNA，在基因转录和转录后调控过程发挥着关键作用[4-6]。

基因编辑技术中以Cas9应用最为广泛，这项技术已用于基因治疗领域[7]。但在基因编辑过程中由于非同源末端连接修复容易出错以及同源重组的频率变化等问题，使得其不能适用于每一种生物体细胞[8]。因此本实验采用了Sakuma T实验室改进的新型CRISPR/PITCH(clustered regularly inters-persed short palindromic repeats-precise integration into target chromosome，CRISPR/PITCH)系统进行基因敲入，通过一段非常短的同源序列(5～25 bp)，将供体载体上目的片段EGFP精确敲入到CSDE1中，构建出稳定表达CSDE1-EGFP的细胞株。相比之下CRISPR/PITCH系统具有更高效、更简洁、更可控的优势，为以后在科学研究、临床治疗中的应用提供了更加方便的可能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与质粒:黑色素瘤细胞系B16购自于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；雌性8周龄C57小鼠购自于中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心。Trans5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)；质粒PX330A-1×2、PX330S-2-PITCH、pCRISPR-PITCH(v2)-FB(Addgene公司)。

1.1.2 试剂:BsaⅠ-HFv2、NheⅠ-HF、SpeⅠ-HF、10×酶切缓冲液和T4连接酶(New England Biolabs公司)；Fast DigestBpiⅠ内切酶、Opti-MEMI培养基和10×酶切缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司)；无内毒素质粒大提试剂盒和琼脂糖回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、基因组提取试剂盒(康为世纪生物技术有限公司)；质粒转染试剂Viafect(Promega 公司)；CSDE1抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR-Cas9载体和CRISPR-PITCH 供体载体的构建:利用微同源末端连接(micro-homology-meditated end joining,MMEJ)方法辅助(图1)，通过一段非常短的同源序列，将供体载体上目的基因(gene of interest,GOI)精确敲入到基因组最后一个外显子上，MMEJ辅助PITCH系统与CRISPR形成CRISPR-PITCH系统。

图1 微同源末端连接(MMEJ)示意图Fig 1 Diagram of micro-homology-mediated end joining(MMEJ)

设计合成mouse-CSDE1-sgRNA引物(表1)，合成的sgRNA引物退火合成DNA双链。用Fast DigestBpiⅠ酶将PX330A-1×2载体酶切成线性载体。连接转化后测序分析选取正确序列的质粒扩大培养，提取重组质粒。

表1 Mouse-CSDE1-knockin-EGFP sgRNA引物序列Table 1 Primer sequences of single guide RNA(sgRNA)

PX330S-gRNA-PITCH线性载体纯化回收，用BsaI-HFv2酶将PX330A-1×2-mouse-CSDE1-sgRNA重组质粒和PX330S-gRNA-PITCH质粒线性载体进行Golden Gate assembly PCR融合。转化涂板后测序分析选取正确序列的质粒扩大培养，提取mouse-CSDE1-all-in-one质粒。

根据EGFP敲入到CSDE1的位置设计引物(表2)。对目的片段进行PCR扩增，纯化回收目的片段。酶切pCRISPR-PITCH-FBL载体，用SpeⅠ-HF、NheⅠ-HF重组酶将纯化的目的片段和载体片段pCRISPR-PITCH-同源重组。转化涂板后测序分析，选取正确序列的质粒扩大培养，提取pCRISPR-PITCH-mouse-CSDE1质粒。

表2 Mouse-CSDE1-infusion目的片段扩增PCR引物序列Table 2 Primer sequences of RNA(RNA) for mouse-CSDE1-infusion

1.2.2 细胞转染及PCR验证:细胞转染流程如图2，以2×105个/孔的密度将B16细胞接种到6孔板中，次日将mouse-CSDE1-all-in-one质粒1.2 μg、pCRISPR-PITCH-mouse-CSDE1质粒0.6 μg及7.2 μL Viafect转染试剂混合逐滴加到6孔板中。6～8 h后换新鲜的RIMP 1640培养基。转染72 h后，加入2 μg嘌呤霉素培养，每3 d更换1次培养基，直至观察到对照组细胞死亡而实验组细胞存活为止。然后分选出EGFP阳性的细胞，并进行单克隆细胞铺板培养。同时设计引物(表3)，PCR验证EGFP是否成功插入B16-CSDE1中。

表3 Mouse-CSDE1-EGFP-PCR引物序列Table 3 Primer sequences of PCR for mouse-CSDE1-EGFP

图2 细胞转染及单克隆培养过程Fig 2 Process of cell transfection and monoclonal culture

1.2.3 免疫荧光检测CSDE1表达的情况:分选出强阳性和弱阳性的B16-CSDE1-EGFP细胞，按照1×105个/片进行甩片(利用涂片机)，甩片后使用免疫染色强力通透液破膜5 min，PBS缓冲液润洗之后，免疫染色封闭液封闭30 min，孵育CSDE1一抗抗体，4 ℃过夜。室温平衡30 min，PBS 缓冲液洗3遍，二抗室温孵育1 h。PBS缓冲液洗3遍后染DAPI，染完后用PBS润洗后封片，荧光显微镜拍照。

1.2.4 活细胞成像:B16-CSDE1-EGFP阳性细胞消化后,使用流式细胞仪分选出强阳性和弱阳性的B16-CSDE1-EGFP细胞、计数，按照5×104个/皿，100 μL RPMI1640培养基重悬细胞后放入皿子中，贴壁后进行荧光显微镜拍摄。

1.2.5 Transwell小室法检测B16细胞体外转移能力:分选出低EGFP表达和高EGFP表达的B16-CSDE1-EGFP细胞，将1×105个细胞接种到24孔板中，将小室放入24孔板中，细胞用无血清培养基200 μL重悬加进上层小室，下层加入400 μL RPMI1640培养基。24 h后使用PBS缓冲液润洗，用棉签轻轻去上层细胞，4%多聚甲醛固定液固定30 min，再次使用PBS缓冲液润洗，最后用结晶紫染料染色30 min，显微镜下观察、拍摄。

1.2.6 动物实验及分组:12只8周龄C57小鼠分为两组，每组各6只，分别皮下接种2.5×105个低表达或高表达CSDE1的B16细胞，每天观察肿瘤生长情况，两周后从荷瘤小鼠体内分离黑色素瘤，拍照并测量肿瘤大小。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CRISPR-Cas9载体和CRISPR-PITCH 供体载体的构建

琼脂糖凝胶电泳结果显示PX330A-1×2载体酶切产物在8 900 bp左右出现一条带(图3A)，插入片段扩增产物和PITCH酶切载体产物分别在约1 600、6 000 bp处出现一条明亮条带(图3B,C),表明扩增及酶切成功。产物融合后测序结果显示载体中EGFP序列成功插入CSDE1的序列,pCRISPR-PITCH-CSDE1 供体载体构建成功。

2.2 PCR成功验证EGFP敲入CSDE1

实验结果显示对照组无条带，实验组在100～250 bp出现一条明亮的条带(图4)，表明EGFP成功敲入CSDE1中。

2.3 活细胞成像和免疫荧光鉴定高、低表达CSDE1阳性的B16-CSDE1-EGFP细胞

弱阳性表达EGFP和强阳性表达EGFP的B16-CSDE1两种细胞成功分选出来(图5A)，EGFP表达强的细胞CSDE1表达量高，EGFP表达弱的细胞CSDE1表达量相对较低(P<0.05)(图5B)。两种B6细胞EGFP表达强度差异显著(P<0.001)(图5C)。

A:M.maker;vector.PX330A-1×2-digest vector;B:M.maker;vector.PITCH-CSDE1-EGFP vector flagment;C:M.maker;vector.PITCH-v2-digest vector图3 CRISPR-Cas9载体和CRISPR-PITCH 供体载体的构建Fig 3 Construction of CRISPR-Cas9 vector and CRISPR-PITCH donor vector

M.maker;control.B16 WT cell;B16-CSDE1-EGFP.monoclonal cell图4 B16-CSDE1-EGFP单克隆细胞PCR验证Fig 4 PCR validation of B16-CSDE1-EGFP monoclonal cells

2.4 CSDE1对黑色素瘤细胞株B16F1转移能力的影响

结晶紫染色后显示高表达CSDE1的B16细胞转移能力强，低表达CSDE1的B16细胞转移能力相对较弱(P<0.001)(图6)。

2.5 CSDE1对C57小鼠荷瘤生长的影响

接种高表达CSDE1细胞的小鼠肿瘤明显大于接种低表达CSDE1细胞的小鼠肿瘤(P<0.001)(图7)。

A.after EGFP was knocked-in,B16-CSDE1-EGFP cells with low expression of CSDE1 and high expression of CSDE1 were selected by flow cytometer;B.immunofluorescence verification of B16-CSDE1-EGFP with low expression of CSDE1 and high expression of CSDE1 and analysis of mean fluorescence intensity,Bar=25 μm;C.the fluorescence protein expression of B16-CSDE1-EGFP with low expression of CSDE1 and high expression of CSDE1 and the mean fluorescence intensity analysis were identified by living cell imaging,Bar=50 μm；*P<0.05,**P<0.001 compared with CSDE1low group图5 B16-CSDE1-EGFP高低表达分选以及荧光强度检测Fig 5 Sorting of high and low expression of B16-CSDE1-EGFP and detection of fluorescence intensity

*P<0.001 compared with CSDE1low group图6 低表达B16-CSDE1细胞和高表达B16-CSDE1细胞转移能力的对比Fig 6 Comparison of low expression B16-CSDE1 cell and high expression B16-CSDE1 cell metastasis

*P<0.001 compared with CSDE1low group图7 低表达B16-CSDE1和高表达B16-CSDE1细胞促进肿瘤生长情况Fig 7 Low expression of B16-CSDE1 and high expression of B16-CSDE1 promoted

3 讨论

基因编辑技术是生物体内核酸酶剪切DNA后形成DNA双链断裂位点(double strand breaks,DSB)，诱导生物体非同源末端链接或同源重组来实现DSB修复[9-10]。目前基因编辑技术在人、鼠、斑马鱼、拟南芥等动植物基因靶向改造、人类疾病预防、动物模型开发等领域中体现出巨大的应用前景。尤其CRISPR/Cas9技术在基因治疗领域已经成为最广泛使用的基因编辑工具。但是大片段同源重组的效率低下和非同源末端连接易出现错误是Cas9应用过程中经常出现的问题。本实验使用的CRISPR/PITCH系统是在CRISPR系统基础上加以改进的基因敲入技术，相比传统的CRISPR/Cas9系统，CRISPR/PITCH系统具有简单、高效的优势，并且更加稳定可控。因此有望成为近几年被广泛应用于生物学各个领域的新颖技术。

通过使用CRISPR/PITCH系统，将EGFP成功插入到CSDE1上。根据EGFP的荧光强度分选出低表达CSDE1与高表达CSDE1的两种细胞，之后对两种细胞进行功能上的探究。后续临床上可以通过在蛋白表达水平上预测肿瘤患者的预后，含有不同CSDE1表达量的肿瘤细胞所表现的特点也会不同。未来靶向治疗CSDE1可以有效抑制黑色素瘤生长以及降低转移能力等，使得转移性黑色素瘤患者的预后得到改善。

从目前来看，CRISPR/PITCH系统的敲入效果很明显，但由于该项敲入技术在国内还尚不成熟，敲入效率仍较低。如何提高敲入效率还需要进一步研究。